초록 ▼

현재 국내외에서 임상 진행 중에 있는 DNA 백신 등 유전자 치료제는 효능은 우수한데 비해 숙주유래 오염물질로 인한 안전성 문제가 지속적으로 대두되어 오고 있다. 그럼에도 불구하고 이들을 in vitro에서 품질관리할 수 있는 정확한 실험방법이나 가이드라인이 설정되어 있지 않은 상황이다.
본 연구는 현재 사용되고 있는 in vitro 시험법이 향후 출시될 DNA 백신이나 바이러스 벡터 유전자치료제에도 있는지, DNA, RNA 및 단백질의 검출이 용이하고 재현성, 특이도 등이 확인되고 검출한계가 설정되어 유전자 치료제의 적절한

현재 국내외에서 임상 진행 중에 있는 DNA 백신 등 유전자 치료제는 효능은 우수한데 비해 숙주유래 오염물질로 인한 안전성 문제가 지속적으로 대두되어 오고 있다. 그럼에도 불구하고 이들을 in vitro에서 품질관리할 수 있는 정확한 실험방법이나 가이드라인이 설정되어 있지 않은 상황이다.
본 연구는 현재 사용되고 있는 in vitro 시험법이 향후 출시될 DNA 백신이나 바이러스 벡터 유전자치료제에도 있는지, DNA, RNA 및 단백질의 검출이 용이하고 재현성, 특이도 등이 확인되고 검출한계가 설정되어 유전자 치료제의 적절한 측정법으로 사용할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다. 본 연구에 사용된 DNA 백신 후보물질은 식약청으로부터, 바이러스벡터 유전자치료제의 모델은 연세대학교 의과대학으로부터 제공 받아 사용하였다.
이를 위하여 제1 세부 과제에서는 DNA 백신에 잔류하는 숙주유래 단백질을 국내 DNA 백신 개발사에서 사용하고 있는 E. coli HCP assay kit(Cygnus Techonologies사)를 사용하여 특이도와 재현성을 확인하였다. 또한 DNA 백신 내에 잔류하는 숙주유래 RNA의 측정법을 정량적으로 측정 할 수 있는 RiboGreen RNA quantitation kit(Molecular PROBES사)를 이용한 RNA의 측정법의 문제점을 발견하고 또 다른 측정방법인 전기영동법과 비교하였다. 또한 DNA 분해효소 등 주성분 유전자에 영향을 미칠 수 있는 처리 공정 후 DNA 백신의 함량변화 측정을 위한 연구를 통하여 DNA 백신의 안정성을 확인하였다. 또한 바이러스벡터 유전자 치료제에 대한 숙주유래 단백질에 관한 측정법은 HEK293 HCP assay kit(Cygnus Techonologies사)를 사용하여 특이도와 재현성을 확인하였다.
제2세부 과제에서는 단백질과 RNA외에 중요한 오염물질인 숙주유래 DNA를 측정할 수 있는 두시험법, DNA hybridization과 Q-PCR을 DNA 백신 후보물질과 바이러스 유전자 치료제 모델을 이용하여 비교, 분석하였다. DNA hybridization 방법과 Q-PCR 방법을 최적화 시켜 두 측정시험법의 특이성, 검출한도, 소요 시간 등을 비교?분석하여 어느 측정시험법이 실질적으로 적합한 방법인지 결과를 제시하였다.
DNA 백신 후보물질을 통하여 실험한 결과 DNA는 Q-PCR로, RNA는 agarose 전기영동법으로, 단백질은 ELISA(HCP assay법)이 적당하였으며, 바이러스벡터 유전자치료제 모델의 실험에서는 DNA는 Q-PCR, 단백질은 ELISA(HCP assay법)이 적용이 가능하였다.

Abstract ▼

The goal of this research project is to prepare the appropriate methods and criteria for consistent quality, safety and reliability of the DNA vaccine and virus vector gene therapeutic drug throughout the study for the measurement method of residual host protein, DNA and RNA in the DNA vaccine and v

The goal of this research project is to prepare the appropriate methods and criteria for consistent quality, safety and reliability of the DNA vaccine and virus vector gene therapeutic drug throughout the study for the measurement method of residual host protein, DNA and RNA in the DNA vaccine and virus vector gene therapeutic drug.
To this end, in part 1 project we tested the specificity and reproducibility of E.coli HCP assay kit(Cygnus Techonologies inc.) to determine host residual protein in DNA vaccine candidate. We tested also the specificity and reproducibility of HEK293 HCP assay kit(Cygnus Techonologies inc.) to determine host residual protein in virus vector gene therapeutic drug model. We tested the RiboGreen RNA quantitation kit (Molecular PROBES Inc.) to quantitative measurement of residual host RNA. But we found some problems about the application to the DNA vaccines. So we compare the another measurement method, gel electrophresis. We studied the change of DNA ingredients in DNA vaccines after the production process that can affect DNA degradation.
In part 2 project, we analyzed and compared the measurement methods, DNA hybridization and Q-PCR, for the residual host DNA, an important contaminats in addition to protein and RNA. we optimized the two methods to prepare the basic data for the specificity, detection limit and the deriving time.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• I. 총괄연구개발과제 요약문 ... 7
• 1. 국문요약문 ... 7
• 2. 영문요약문 ... 9
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 11
• 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 11
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ... 11
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ... 16
• 1.3 총괄국내 ? 외 기술개발 현황 ... 17
• 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ... 21
• 2.1 연구내용 ... 21
• 2.2 연구방법 ... 22
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 27
• 3.1 숙주유래 단백질 측정 시험법 연구 ... 27
• 3.2 DNA 백신에 대한 숙주유래 RNA 측정 시험법 연구 ... 32
• 3.3 숙주유래 DNA 측정 시험법 연구 ... 37
• 3.4 DNA 분해효소 등 주성분 유전자에 영향을 미칠 수 있는 처리 공정후 DNA 백신의 함량 변화 측정 ... 58
• 3.5 DNA 분해효소 등 주성분 유전자에 영향을 미칠 수 있는 처리 공정후 바이러스백터 유전자치료제의 함량 변화 측정 ... 60
• 3.6 국내외 가이드라인과 결과의 비교 ... 61
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 63
• 4.1 총괄활용성과 ... 63
• 4.2 총괄활용계획 ... 64
• 제5장 총괄주요연구 변경사항 ... 65
• 제6장 총괄참고문헌 ... 66
• 제7장 총괄첨부서류 ... 71
• 제(1)세부연구개발과제 연구결과 ... 72
• 제(1)세부 연구개발과제 요약문 ... 73
• 제2장 세부연구개발과제의 목적 ... 75
• 2.1 세부연구개발과제의 목적 ... 75
• 2.2 세부연구개발과제의 목표달성도 ... 77
• 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ... 78
• 3.1 연구내용 ... 78
• 3.2 연구방법 ... 78
• 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ... 82
• 4.1 DNA 백신에 대한 숙주유래 단백질 측정 시험법 연구 ... 82
• 4.2 DNA 백신에 대한 숙주유래 RNA 측정 시험법 연구 ... 84
• 4.3 바이러스백터 유전자치료제에 대한 숙주유래 단백질 측정 시험법 연구 ... 89
• 4.4 DNA 분해효소 등 주성분 유전자에 영향을 미칠 수 있는 처리 공정 후 DNA 백신의 함량 변화 측정 ... 92
• 4.5 DNA 분해효소 등 주성분 유전자에 영향을 미칠 수 있는 처리 공정 후 바이러스백터 유전자치료제의 함량 변화 측정 ... 94
• 제5장 세부참고문헌 ... 96
• 제(2)세부연구개발과제 연구결과 ... 97
• 제(2)세부 연구개발과제 요약문 ... 98
• 제2장 세부연구개발과제의 목적 ... 100
• 2.1 세부연구개발과제의 목적 ... 100
• 2.2 세부연구개발과제의 목표달성도 ... 102
• 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ... 104
• 1. 연구내용 ... 104
• 2. 연구방법 ... 104
• 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ... 107
• 1. DNA hybridization 측정시험법 validation 결과 ... 107
• 2. Q-PCR 측정시험법 validation 결과 ... 116
• 3. 두 측정시험법의 장단점 비교 및 한계성 평가 ... 126
• 4. 결론 ... 127
• 제5장 세부참고문헌 ... 128
• 끝페이지 ... 128