초록 ▼

본 연구에서는 나노물질의 안전성 평가를 위한 in vivo 독성평가 기법을 확립하고자 하였으며, 나노물질 의 종류가 매우 다양하고 고유한 성질을 가지고 있기 때문에 대표적으로 NTP에서 standard 물질로 선정한 골드 나노물질에 대하여, 입자 표면의 전하(양성, 음성)에 따른 in vivo에서의 독성평가를 수행하였다. 또한 2008년 연구사업에서 4, 13, 100 nm 사이즈의 구형 금나노물질을 사용한 실험 결과 13 nm 사이즈 입자가 간과 비장에서 apoptosis를 유발하는 것을 확인하여 2009년도에는 13 nm의 금나

본 연구에서는 나노물질의 안전성 평가를 위한 in vivo 독성평가 기법을 확립하고자 하였으며, 나노물질 의 종류가 매우 다양하고 고유한 성질을 가지고 있기 때문에 대표적으로 NTP에서 standard 물질로 선정한 골드 나노물질에 대하여, 입자 표면의 전하(양성, 음성)에 따른 in vivo에서의 독성평가를 수행하였다. 또한 2008년 연구사업에서 4, 13, 100 nm 사이즈의 구형 금나노물질을 사용한 실험 결과 13 nm 사이즈 입자가 간과 비장에서 apoptosis를 유발하는 것을 확인하여 2009년도에는 13 nm의 금나노(13 nm AuNP)의 반복투여에 따른 독성평가를 수행하였다.
금나노의 표면전하에 따른 생체내 분포 및 독성을 비교하기 위해 30 nm 크기의 양전하를 표면처리한 금나노(+AuNP) 및 음전하를 표면처리한 금나노(-AuNP)를 합성하여 농도별로 단회 정맥투여하고 5분, 30분, 1시간, 4시간, 24시간, 7일째에 부검하여 생체내 분포를 조사하였다. 단회투여 후 7일 동안 +AuNP 및 -AuNP는 임상증상, 체중, 장기, 혈액생화학, 조직병리학적 소견에서 대조군과 차이를 보이지 않았으며 전자현미경을 통한 조직내 분포의 결과에서 간, 비장, 림프절 외에 신장과 폐에서도 +AuNP와 -AuNP가 동일하게 관찰되어 +AuNP와 -AuNP간에 뚜렷한 차이를 발견할 수 없었다. 다만 조직내 분포량은 시간별로 차이를 보였는데 투여후 4시간부터 7일에 걸쳐 -AuNP에서 조직의 분포량이 +AuNP보다 높았다. 소변을 통한 배출도 매우 적은 양이지만 이루어졌는데 투여후 7일까지 관찰한 결과 +AuNP가 투여 후반으로 갈수록 배출량이 적어진 반면 -AuNP는 투여 7일째까지 지속적으로 증가하는 양상을 보였다.
간조직을 이용하여 염증성 사이토카인 및 키모카인의 mRNA 발현 변화를 관찰한 결과 Real time PCR 결과에서 +AuNP에 비하여 -AuNP에서만이 염증성사이토카인과 키모카인의 증가가 투여후 30분째에 급격히 증가하여 microarray 결과 대조군과 비교하여 1.5배 이상 차이나는 유전자는 각각 +AuNP 16개, -AuNP 63개로 +AuNP에 비해 -AuNP에서 유전자 발현의 변화가 큰 것으로 사료되었다. 비장의 면역세포에 미치는 영향을 관찰한 결과 단회투여후 24시간 째에 -AuNP 투여군에서 활성화된 helper T림프구가 감소하고 regulatory T 림프구가 -AuNP 고농도 투여군에서 통계적으로 유의한 증가를 보였다. B림프구의 costimulatory molecule도 -AuNP 고농도군에서 감소경향을 보여서 면역세포의 활성이 -AuNP에서 약간 감소하는 것으로 판단되었으며 이는 13 nm AuNP를 단회정맥투여한 후 면역세포의 활성을 관찰한 결과와 유사하였다.
13 nm AuNP를 수컷 및 암컷 Balb/c 마우스에 14일 반복투여 결과 시험물질에 의한 사망개체는 없었고, 체중이나 임상증상도 대조군과 차이가 없었다. 부검소견으로는 간, 비장, 림프절의 변색이 관찰되었고 혈액학적검사에서 수컷 중농도에 백혈구 증가가 관찰되었고 암컷 중농도에서는 ALT의 증가가 관찰되었다. 조직분포를 전자현미경으로 관찰한 결과 단회투여에서 관찰한 장기 외에 심장, 난소에서도 금나노가 관찰되었으나, 뇌나 고환의 실질조직에서는 금나노가 관찰되지 않았다. 수컷 Balb/c 마우스를 이용하여 비장의 면역세포의 활성을 관찰한 결과 중농도, 저농도 투여군에서 helper T 림프구가 활성화되고 B림프구가 중농도에서는 유의적으로 감소하였으나 B 림프구가 활성화될 때 나타나는 CD44는 발현하였다. 대식세포에서는 고농도군에서 대식세포의 co-stimulatory molecule과 MHC II 발현이 증가하였다. 이는 13 nm의 단회투여시에는 감소되는 경향을 보였던 활성화된 B 또는 T 림프구가 나노물질의 정맥내 반복투여에 의한 지속적 자극에 의해서 반대로 활성화됨 을 알 수 있었다.
13 nm AuNP와 결합한 혈장 단백질을 관찰한 결과 주로 항체나 보체, albumin등의 단백질이었으며 in vitro로 FBS와 금나노를 결합시킨 경우와 금나노를 투여한 마우스의 혈액으로부터 분리한 혈장에서 동정된 단백질의 종류에는 차이를 보였다.
본 연구결과를 통하여 금나노 입자 표면의 전하(양성, 음성)에 따른 in vivo에서의 생체 내 분포량 및 간에서의 유전자발현이 차이가 있음을 관찰하였으며 13 nm 금나노의 반복투여에 따른 독성을 단회투여와 비교하여 보았다. 이를 바탕으로 국제학술지에 연구결과 발표를 통하여 금나노의 특성에 따른 안전성평가방법을 확립하고 독성의 발현 기전에 대한 이해를 증진하고자 한다.

Abstract ▼

The aim of this study is to establish in vivo toxicity test method for nanomaterials, therefore we studied on gold nanoparticles(AuNPs) selected as standard material by National toxicology programme(NTP). We conducted in vivo toxicity studies with 30 nm sized positive charged AuNPs(+AuNP) or negativ

The aim of this study is to establish in vivo toxicity test method for nanomaterials, therefore we studied on gold nanoparticles(AuNPs) selected as standard material by National toxicology programme(NTP). We conducted in vivo toxicity studies with 30 nm sized positive charged AuNPs(+AuNP) or negative charged AuNPs(-AuNP). In addition, we conducted repeated dose toxicity test of 13 nm sized AuNP because 13 nm sized AuNPs induced apoptosis in liver and spleen in our previous study.
To compare toxicity and tissue distribution between +AuNPs and -AuNPs, samples were taken 5 min, 30 min, 1h, 4h, 24h, 7 days post single intravenous injection of +AuNPs or -AuNPs. +AuNPs or -AuNPs did not induce significant changes in clinical signs, body weight, organ weight, hematology, blood chemistry and histopathological findings compared to vehicle control group.However, tissue distribution was different at several time points. The concentration of -AuNPs in several organs was significantly higher than that of +AuNPs from 4 hr to 7 days. A small amount of AuNPs was excreted through urine and stool. The concentaration of +AuNPs in urine was decreased, in contrast -AuNPs had been increased continuoulsy for 7 days. In transmission electron microscopy(TEM) images, both +AuNPs and -AuNPs were found in tissues of liver, spleen, lymphnode, kidney and lung.
We investigated mRNA expression level of inflammatory cytokines and chemokines using liver tissue at 30 min post-injection by real-time PCR. -AuNPs only increased mRNA expression of inflammatory cytokines and chemokines. In the result of Microarray, 63 genes of -AuNP and 16 genes of +AuNP were differently expressed compared with vehicle control.
AuNP also affected the function of immune cells including of spleen. -AuNPs treated groups decreased helper T lymphocytes and coarticulatory molecules in B lymphocytes and increased regulatoty T lymphocytes. Therefore -AuNPs had a tendency to down regulate immune cells. Single intravenous injection of 13 nm AuNPs showed similar effect on immune cells.
In the 14 day repeated dose toxicity test of 13 nm AuNP using Balb/c mice, no toxic effects were observed in clinical sign, mortality, body weight. In hematology and blood chemistry, WBC increased in male mid- dose group and ALP increased in female mid-dose group. The color of liver, spleen, lymph node was darkly changed in necropsy finding. 13 nm AuNPs were found in the tissues of liver, spleen, lymph node, kidney, lung, heart and ovary except for brain and testis by TEM. 13 nm AuNP activated immune cells of spleen by repeated dose administration.
Plasma proteins that bind the surface of 13 nm AuNPs were mainly antibodies, complements, albumins. There was some difference between proteins identified from FBS and mouse plasma. Taken together, +AuNPs and -AuNPs showed some difference in tissue distribution at time point, gene expression level and effect on immune cell and we gained repeated dose toxicity data of 13 nm AuNPs compared with single dose toxicity data. Our data plan to be submitted to international journal and used a toxicity evaluation of gold nanomaterials.

목차 Contents

• 자체연구개발과제 최종보고서 ...1
• 표지 ...2
• 국문요약문 ...3
• 영문요약문 ...4
• 목차 ...5
• 제1장 연구개발과제의 개요 ...6
• 제1절 연구개발과제의 목표 ...6
• 제2절 연구개발과제의 필요성 ...7
• 제2장 연구개발과제의 국내?외 연구개발 현황 ...9
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과, 고찰 및 결론 ...11
• 제1절 연구수행방법 ...11
• 제2절 연구수행의 결과 ...20
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...78
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...81
• 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획 ...81
• 제1절 활용성과 ...81
• 제2절 활용계획 ...83
• 제7장 참고문헌 ...84
• 제8장 첨부서류 ...88