초록 ▼

세포치료제는 일반의약품과 달리 개발에서 환자로의 투여까지 일정한 시간 내에 이루어지는 특성이 있고, 연구와 개발과정 동안 여러 단계에서 미생물학적 위해성 및 안전성을 평가하여야 한다. 따라서 직접배양법에 의한 미생물 오염의 판정은 긴 시간을 요구하며, 체외배양이 어려운 미생물에 대한 부정시험법으로 적당하지 못하다. Mycoplasma는 현미경적관찰이 불가능하고 체외 세포배양 과정에서 오염이 빈발하는 미생물로 오염의 인지도 용이하지 않다. 따라서 본 연구에서는 공정서에 수재된 직접배양법으로 검출이 용이하지 않은 Mycoplasma의

세포치료제는 일반의약품과 달리 개발에서 환자로의 투여까지 일정한 시간 내에 이루어지는 특성이 있고, 연구와 개발과정 동안 여러 단계에서 미생물학적 위해성 및 안전성을 평가하여야 한다. 따라서 직접배양법에 의한 미생물 오염의 판정은 긴 시간을 요구하며, 체외배양이 어려운 미생물에 대한 부정시험법으로 적당하지 못하다. Mycoplasma는 현미경적관찰이 불가능하고 체외 세포배양 과정에서 오염이 빈발하는 미생물로 오염의 인지도 용이하지 않다. 따라서 본 연구에서는 공정서에 수재된 직접배양법으로 검출이 용이하지 않은 Mycoplasma의 대체 부정시험법을 개발하여 세포치료제의 미생물학적 안전성을 확보하고자 하였다. 먼저 Mycoplsma 오염의 대부분을 차지하는 빈발성 Mycoplasma 14종 (M. arthritidis, M. bovis, M. fermentans, M. genitalium, M. hominis, M. hyohinis, M. neurolyticum, M. orale, M. pirum, M. pneumoniae, M. pulmonis, M. salivarium, U. urealyticum, A. laidlawii)의 검출을 위한 PCR 유전자 증폭법을 개발하였다. 우선 직접배양 법에서 수내지 수십 CFU의 Mycoplasma 종이 2주의 배양시간에 검출 가능함이 확인되었다. 이때 균종의 확인은 불가능하였고 단지 고제배양에서의 colony 형성이나 액체배양에서 indicator dye의 색깔 변이에 의하여 Mycoplasma의 존재가 판정되었다. 유전자 증폭에 의 한 검출법은 하나의 genome에 수십 copy이상이 존재하는 Ribosomal RNA 유전자를 대상으로 Two stage nested PCR법을 확립함으로서 검출의 감도를 1-10 CFU의 개체도 검출할 수 있도록 균종별 rDNA 염기서열에 따라 최적화하였다. 더욱이 이들 rDNA에 대한 clone 을 확보하여 검출반응의 검증용 positive standard control로 이용할 수 있도록 하였고, 이들 의 PCR product를 Restriction enzyme Sau3AI으로 절단하여 확인 가능하도록 RFLP법을 확립하였다. 기존의 시판 제품과의 비교분석 시험으로부터 본 연구에서 설정한 시험법이 적어도 10배 이상의 우수한 감도를 지님이 확인되었다. 또한 검출기법의 특이성과 재현성을 구현함으로서 검출 시험법의 결과에 대한 신뢰도를 향상시켰다. 따라서 본 연구에서 개발한 Mycoplasma 검출 시험법은 세포치료제에 오염된 Mycoplasma를 고감도로 단시간에 검출 가능하게 함으로서 세포치료제의 미생물학적 안전성 확보에 크게 기여하였다고 사료된다.

Abstract ▼

Human cells are important resources for medical treatments and after ex vivo propagation, expansion, and selection, can be used to treat many people. The cellular products can transmit diseases originated from microbiological contaminations in donor tissue or culture substrates. Products for cell th

Human cells are important resources for medical treatments and after ex vivo propagation, expansion, and selection, can be used to treat many people. The cellular products can transmit diseases originated from microbiological contaminations in donor tissue or culture substrates. Products for cell therapy, not for chemotherapy, have a distinct characteristic of time limitation from development to administration into patients and should be tested for microbiological safety at multiple steps of development and administration. Culture methods to detect microbes contaminated into biologics are not applicable to detect non- or hardly culturable microorganisms because of sensitivity and time limitation. Mycoplasmas, not observed with light microscope, are frequently contaminated into in vitro culture. Their cryptic contamination can be recognized with specific procedures, such as color change of dye in culture media, ELISA to detect a specific enzyme, or PCR methods. In order to develop an efficient method of mycoplasma detection, we adopted PCR procedure to detect 14 common contaminates (M. arthritidis, M. bovis, M. fermentans, M. genitalium, M. hominis, M. hyohinis, M. neurolyticum, M. orale, M. pirum, M. pneumoniae, M. pulmonis, M. salivarium, U. urealyticum, A. laidlawii). In cultural method, their growth were recognizable after cultivation of 2 weeks, suggesting that cultural method is not applicable to cell-based products to test mycoplasma contamination. In PCR method, rDNA genes of 14 species showing compromised sequence similarity were targeted with two sets of primer pairs, one for primary PCR and the other for nested PCR. The two stage nested PCR method developed in this study gave us high sensitivity to detect about 1 copy of the target gene and is 10 times more sensitive than a commercial product when the test was applied to subclinical samples spiked with genomic DNA of mycoplasma. And the test method created in this study showed higher level of specificity and reproducibility. RFLP (restriction fragment length polymorphism) was developed with Sau3AI digestion to differentiate species of contaminated mycoplasmas. The obtained results provide an evidence that the assay system is a good tool for supporting the diagnosis of mycoplasma contamination, thereby being applicable as Microbiological Safety Test for evaluating contamination of mycoplasmas within cellular based products.

목차 Contents

• 연구결과보고서 ...1
• 제출문 ...2
• 국문요약문 ...3
• 영문요약문 ...4
• 목차 ...5
• 제1장. 서론 ...6
• 1. 연구목적 및 필요성 ...6
• 제2장. 국내.외 기술개발 현황 ...11
• 제3장. 연구개발 수행 내용 및 결과 ...13
• 1. 연구내용 및 결과 ...13
• 2. 연구방법 ...31
• 제4장. 연구개발 목표 달성도 및 대외기여도 ...33
• 제5장. 연구개발 결과의 활용성과 및 계획 ...34
• 가. 계량적 성과 ...34
• 나. 성과내용기술 ...34
• 다. 활용계획 ...34
• 제6장. 기타 중요 변경사항 ...34
• 제7장. 참고문헌 ...35
• 연구(세부)과제 요약 ...37