보고서 정보
주관연구기관 |
고신대학교 산학협력단 |
연구책임자 |
장명웅
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2007-06 |
과제시작연도 |
2006 |
주관부처 |
식품의약품안전청 |
사업 관리 기관 |
식품의약품안전청 Korea Food & Drug Administration |
등록번호 |
TRKO201000015787 |
과제고유번호 |
1470001488 |
사업명 |
의약품안전연구개발 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
Mycoplasma 부정시험법.검증.Test for Mycoplasma.Validation.
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초록
▼
현 공정서에 수재된 Mycoplasma부정시험법이 대량 생산체제에는 적합하나 생산량이 적은 세포치료제에 적용하기에는 부적당함으로 세포치료제의 특성에 부합한 시험법을 확립할 목적으로 본 연구를 시행하였다. Vero 세포가 5x$10^{4}$/ml 밀도로 배양된 10ml의 25T 배양병 30개에 균의 밀도가 1, $10^{1}$, $10^{2}$, $10^{3}$, $10^{4}$ cfu/ml 되도록 조정한 M. hyorhinis, M.
현 공정서에 수재된 Mycoplasma부정시험법이 대량 생산체제에는 적합하나 생산량이 적은 세포치료제에 적용하기에는 부적당함으로 세포치료제의 특성에 부합한 시험법을 확립할 목적으로 본 연구를 시행하였다. Vero 세포가 5x$10^{4}$/ml 밀도로 배양된 10ml의 25T 배양병 30개에 균의 밀도가 1, $10^{1}$, $10^{2}$, $10^{3}$, $10^{4}$ cfu/ml 되도록 조정한 M. hyorhinis, M. orale, M. pneumoniae 균액을 각각 1ml 씩 접종한 실험군과 균을 접종하지 않은 대조군 1병, 모두 6병을 1 set로, 5 set를 접종하였다. 접종 당일(0일), 3, 7, 14, 21일 후에 각각 한 set씩의 배양병에서 세포배양상등액과 세포부유액으로 나누고 이를 각각 0.01, 0.02, 0.04, 0.2 또는 1 ml 씩 취하여 1) 증균배양법, 2) 직접도말배양법, 3) 멤브레인필터법, 4)
DNA 염색법, 5) PCR, 6) 소량배양법으로 마이코플라스마의 존재 유무를 확인하여 다음과 같은 결론을
얻었다.
1) 증균배양법에서 액체배지 10 ml와 2 ml에 M. orale, M. hyorhinis, M. pneumoniae의 각 밀도별 균액을 0.2 ml, 0.02 ml 씩을 각각 접종하여 5% $CO_{2}$ 부란기나 일반 부란기에 배양한 결과 배지양에 따른 차이는 없었다.
2) 증균배양법에서 M. orale는 3-7일, M. hyorhinis는 3-14일, M. pneumoniae는 3-21일 후 까지 균이 검출이 되었으나, 이 후는 모든 균종이 사멸하였다.
3) 직접도말배양법에서는 공정서에 수재된 Mycoplasma부정시험용 한천평판배지 I, II에서 3가지 균종의 증식은 PPLO 한천평판배지에 비하여 균의 증식 정도가 좋지 않았다.
4) 멤브레인필터법에서는 배지의 양이 많은데 비하여 다른 배양법에서 보다 더 민감한 결과는 얻지 못하였다.
5) PCR법으로는 균의 밀도가 $10^{1}$/ml 이상이면 검출이 가능하였다.
6) DNA 염색법으로는 균 접종3-7일 후에 균의 밀도가 $10^{1}$-$10^{4}$/ml일 때 검출이 가능하였다.
7) 소양검체를 이용한 검사법에서 24 well plate에 액체배지 2 ml에 가검물 0.04, 0.02, 0.01ml를 접종하거나, 96 well plate에 액체배지 0.2ml에 가검물 0.02, 0.01 ml를 접종하면, 배양 3-7일 후 균의 밀도가 $10^{2}$/ml 이상이면 균의 검출이 가능하였다.
결론적으로 본 연구를 통하여 공정서에 수재되어 있는
1) 마이코플라스마부정시험용 액체배지 및 한천평판배지 I, II는 PPLO 액체배지 및 한천평판배지로 교체하는 것,
2) 소량검체의 경우 10 ml의 시험관 보다는 2 ml의 24 well plate를 이용하는 것,
3) 평판배양법에서 9 cm 보다는 5.5 cm의 평판배지를 이용하는 것이 좋을 것으로 생각된다. 또한
4) PCR법, 5) DNA법을 추가로 하여 실시하는 방법으로 개선하는 것이 좋을 것으로 생각 한다.
그러나 이를 재검증 할 추가 실험이 필요하다고 생각한다.
Abstract
▼
Validation of test for mycoplasma contamination according to guideline of FDA are available for the test of large amount of biomaterials, but that are unsuitable for the small amount of biomaterials. The purpose of this study are estabilished the method for the detection ofmycoplasma contamination i
Validation of test for mycoplasma contamination according to guideline of FDA are available for the test of large amount of biomaterials, but that are unsuitable for the small amount of biomaterials. The purpose of this study are estabilished the method for the detection ofmycoplasma contamination in the small amount of bioproducts. Vero cells were cultured and adjusted to 5x$10^{4}$/ml of the cell numbers, and 1 ml of these cell suspension were devided in the 30 each 25T culture bottles. One ml of 1, $10^{1}$, $10^{2}$, $10^{3}$, $10^{4}$ cfu/ml of M. hyorhinis, M. orale, M. pneumoniae culture solution was inoculated in the each 25T culture bottles and cultured in 5% $CO_{2}$ and general incubator, and 0, 3, 7, 14, and 21 days after incubation, and separted the cell culture supernatant and cell suspension from the one set of the culture bottles. The cell suspension and supernatant were tested by 1) enrichment culture, 2) agar plate, 3) membrane filter, 4) PCR, 5) DNA stain, and 6) small volume method with the medium for validation of test for mycoplasma I and II broth and agar and/or PPLO broth and agar plates, and 2 ml of 24 well plates, and 0.2 ml of 96 well plates.
The results were summerized as follows; The detection rate of mycoplasmas from the 10ml of tubes and 2 ml of 24 well plate were not difference between 0.2 and 0.02ml of the samples. M. orale was detected within 3-7 days, M. hyorhinis was detected within 3-14 days, M. pneumoniae was detected within 3-21 days after incubation. The PPLO broth and agar mediaare available for the detection of mycoplasmas compare with the media existing guideline for mycoplasma detection. PCR and DNA stain method are available for mycoplasma detection. The 2 ml of media in 24 well plate are available for the detection of mycoplasma with 0.2 ml of test sample. The 0.2 ml of media in 96 well plate are available for the detection of mycoplasm with 0.02 ml of test sample. We recommend that PPLO media are very good for mycoplasma detection media, and 2 ml of media in 24 well plate are suitable for small amount(0.2 ml,
0.02ml) of bioproduct.
목차 Contents
- 연구결과보고서 ...1
- 제출문 ...2
- I. 연구결과보고서 요약문 ...3
- 국문요약문 ...3
- 영문요약문 ...4
- II. 총괄연구개발과제 연구결과 ...5
- 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ...5
- 1.1 총괄연구개발과제의 목표 ...5
- 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도 ...5
- 1.3 국내.외 기술개발 현황 ...5
- 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ...7
- 1. 연구 내용 ...7
- 2. 연구 방법 ...7
- 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ...15
- 제1절 Vero 세포배양 중에 M. orale를 감염시킨 후 검색 결과 (1차시험) ...15
- 제2절 Vero 세포배양 중에 M. orale를 감염시킨 후 검색 결과 (2차시험) ...25
- 제3절 Vero 세포배양 중에 M. hyorhinis를 감염시킨 후 검색 결과 (1차시험) ...32
- 제4절 Vero 세포배양 중에 M. hyorhinis를 감염시킨 후 검색 결과(2차) ...45
- 제5절 Vero 세포배양 중에 M. pneumoniae를 감염시킨 후 검색 결과 ...52
- 제6절 24, 96 well을 이용한 소량 검색 결과 ...66
- 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ...71
- 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ...74
- 1. 활용성과 ...74
- 2. 활용계획 ...75
- 제6장 기타 중요변경사항 ...76
- 제7장 참고문헌 ...77
- 제8장 첨부서류 ...78
- 총괄 연구과제 요약 ...82
- 표지 ...84
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