초록 ▼

최근 식습관등 생활환경의 변화에 따라 허혈성심질환(IHD)의 유병율 및 이에 따른 사망률이 급증하여 사회적 비용이 계속해서 증가하고 있다. 그러나 다양한 원인에 의한 질환이며 비만, 흡연, 식습관, 당뇨 등의 조절이 필요하고 약물에 의한 완치가 힘들며, 궁극적으로는 내？외과적 수술요법이 필요하여 새로운 개념의 치료제 개발이 절실한 상황이다. VEGF는 여러 가지 암세포들과 혈관평활근세포, 심근세포, 골격근세포 등에서 분비되나 내피세포에서는 만들어지지 않는 성장인자로서 다른 혈관신생인자들과는 달리 내피세포에만 특이적으로 작용한다. H

최근 식습관등 생활환경의 변화에 따라 허혈성심질환(IHD)의 유병율 및 이에 따른 사망률이 급증하여 사회적 비용이 계속해서 증가하고 있다. 그러나 다양한 원인에 의한 질환이며 비만, 흡연, 식습관, 당뇨 등의 조절이 필요하고 약물에 의한 완치가 힘들며, 궁극적으로는 내？외과적 수술요법이 필요하여 새로운 개념의 치료제 개발이 절실한 상황이다. VEGF는 여러 가지 암세포들과 혈관평활근세포, 심근세포, 골격근세포 등에서 분비되나 내피세포에서는 만들어지지 않는 성장인자로서 다른 혈관신생인자들과는 달리 내피세포에만 특이적으로 작용한다. Human VEGF는 mRNA의 alterative splicing에 의하여 4개의 서로 다른 isoform (206, 189, 165, 121개의 아미노산으로 구성된 VEGF)이 존재하며 signal peptide가 있어 분 비가 가능한데 이들 isoform들은 bioactivity는 비슷하나 bioavailability가 다른 것으로 알려져 있다. VEGF121은 약산성의 polypeptide로서 헤파린과 결합하지 않고 자유롭게 분비되어 free soluble form으로 존재하며, VEGF165는 염기성으로 헤파린과 결합하는데 상당량은 세포표면과 세포외기질 (extracellular matrix; ECM)에 결합되어 일부만 분비되고, VEGF189와 VEGF206은 염기성이 더욱 강하여 헤파린과 강력하게 결합하며 대부분이 세포표면과 ECM에 결합되어 분비되지 않으며, 이들은 당화단백 (glycosylated protein) homodimer로 작용한다. pGT2-VEGF는 동아제약(주)에서 개발중인 허혈성심질환 치료용 유전자 치료제로서 생체내 혈관신생인자인 VEGF의 발현을 통한 내피세포의 성장을 촉진하고 이동을 증가시킴으로서 허혈상태를 개선하는 약물이다. 허혈성 심질환 유전자 치료제는 기존의 약물에 비하여 뛰어난 치료효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며, 현재 국내외적으로 전임상 및 임상단계에서 많은 연구가 진행중에 있다. 그러나 개발경험을 보유한 기업체나 이를 관리하는 국가기관의 관리경험의 부족으로 체계적인 유전자치료제의 전임상독성평가 규정은 부족한 실정이다.
본 연구는 국내외 유전자 치료제의 면역독성 관련규정과 발표논문 등을 근거로 하여 pGT2-VEGF의 면역 독성평가를 수행하였다. 시험동물은 인간의 SLE (Systemic Lupus Erythematosus)와 유사한 특징을 나타내는 것으로 알려진 NZBW F1 마우스를 이용하여 1회/2주 간격으로 총 8회 근육투여 하였으며, 이 후 부검하여 혈중 anti-pGT2-VEGF antibody 및 autoantibody의 변화, autoantibody secreting B cell 수의 변화, IFN-gamma secreting T cell 수의 변화, CD subpopulation의 변화, 신장 및 근육에 대한 병리조직학적 검사를 수행하여 시험물질이 자가면역질환 경과에 미치는 영향을 평가하였다.
본 연구는 유전자치료제의 안전성평가를 다년간 수행했던 동아제약(주) 연구소의 경험과 축적된 지식을 바탕으로 하여 새로운 허혈성심질환 치료제인 pGT2-VEGF의 면역독성을 평가함으로서, 1) 유전자치료제의 평가경험 공유와 2) 유전자 치료제의 안전성 평가 규정 보완에 도움이 되고자 하며, 3) 최종적으로는 pGT2-VEGF의 성공적인 개발을 위한 전임상독성평가 수행에 큰 기여를 하리라 사료된다.

Abstract ▼

Cardiovascular disease is a leading cause of morbidity and mortality in western countries. Current treatment has been based on pharmacological agents and strategies that restore myocardial revascularization, such as percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA) and coronary artery bypass gra

Cardiovascular disease is a leading cause of morbidity and mortality in western countries. Current treatment has been based on pharmacological agents and strategies that restore myocardial revascularization, such as percutaneous transluminal coronary angioplasty (PTCA) and coronary artery bypass graft (CABG) surgery for CAD. Although the substantial advances has been made in the treatment strategy for this disease, there are a large number of patients who have persistent symptoms and are not candidates for the current therapeutic strategies. Therefore, there is much need for alternative strategies such as therapeutic angiogenesis. Therapeutic angiogenesis, administration of angiogenic growth factors as recombinant proteins or genes to enhance myocardial collateral vessel formation, has lately received much attention as a potential future alterative treatment of CAD. Particularly, gene therapy may holds much promise as a potential treatment for advanced ischemic disease untreatable by balloon dilatation or bypass surgery. Angiogenesis stimulation by means of genes for angiogenic factors is a novel approach that has been the focus of several clinical trials.
The VEGF family consists of several members that share structural homology with VEGF-1, VEGF-C (VEGF-2), VEGF-B (VEGF-3), VEGF-D, VEGF-E, and placental growth factor (PlGF). VEGF-1 also has several isoforms with different of numbers of amino acids, generated through alternative splicing VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 and VEGF206, respectively. VEGF121, VEGF165, and VEGF189 have been shown to have similar angiogenic potency in a rabbit model of hind limb ischemia. Naked DNA has successfully been used for VEGF165 gene transfer in an animal model of chronic myocardial ischemia, and naked DNA encoding VEGF165 improved collateral flow in ischemic myocardium. We have developed pGT2-VEGF, a plasmid DNA expressing VEGF165 for the treatment of ischemic heart disease. On the other hand, to facilitate the initiation of clinical trials of gene therapy, the US FDA developed a “Points to Consider　document” in 1996 describing how the manufacture and safety of DNA vaccines planned for clinical use would be evaluated. In Europe, the EMEA also published a　"Note for Guidance on the Quality, Preclinical and Clinical Aspects of Gene Transfer Medicinal Products"　in 2001 describing preclinical pharmacological and toxicological evaluation of gene transfer products. However, there were little established guidelines to evaluate the safety of gene therapeutic agents. Previously, we had conducted preclinical evaluation for the three naked DNA product, VMDA 3601, GX-12 and HB110, which were a naked DNA for the treatment of peripheral arterial occlusive disease, HIV infection and HBV infection, respectively. Based on these experience, we conducted immunotoxicity studies of pGT2-VEGF, for the treatment of ischemic heart disease. Immunotoxicity was evaluated in SLE-prone NZBW F1 mice whether pGT2-VEGF induce the production of anti-pGT2-VEGF antibodies, accelerate the development of autoimmunity and induce the changes in T cell subpopulation. Repeated administration of pGT2-VEGF did not induce the anti-pGT2-VEGF antibody. It did not alter the onset or course of autoimmune disease in these animals in the respect of the anti-DNA or anti-myosin autoantibody titer in serum, the number of B cells secreting IgG autoantibodies reactive with the mammalian DNA and the muscle cell antigen myosin, and immune complex deposition in kidney. T cell subpopulation also did not show any changes.
These results would provide the scientific rationale to establish the safety guideline for gene therapy and will be helpful to the development of pharmaceutical industry.

목차 Contents

• 표지 ...1
• 용역연구개발사업최종보고서 ...2
• 제출문 ...3
• 연구사업 최종보고서 요약문 ...4
• 국문요약문 ...4
• 영문요약문 ...5
• 목차 ...6
• 제1장 서론 ...7
• 제1절. 허혈성 심질환 ...7
• 제2절. VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) ...7
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ...13
• 제1절. 유전자 치료제의 면역독성 평가 ...13
• 제2절. 국내외 허혈성 심혈관 치료제 연구동향 ...13
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...15
• 제1절. 연구수행 방법 ...15
• 제2절. 연구수행 결과 ...18
• 제3절. 결론 및 고찰 ...33
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...37
• 제1절. 시험물질 투여 및 부검 (추진일정 4월~6월) ...37
• 제2절. 혈중 anti-DNA antibody 측정(추진일정 7월~8월) ...37
• 제3절. 혈중 autoantibody 측정(추진일정 7월~8월) ...37
• 제4절. IgG 분비 B cell 및 IFN-gamma 분비 Tcell 수 측정 (추진일정 7월~8월) ...37
• 제5절. CD subset의 변화 측정 (추진일정 8월~9월)...37
• 제6절. 조직검사 (면역염색 포함) (추진일정 9월~10월) ...38
• 제5장 연구개발결과의 활용성과 및 계획 ...39
• 제1절. 계량적 성과 ...39
• 제2절. 성과내용기술 ...39
• 제3절. 활용계획 ...39
• 제6장 기타 중요변경사항 ...39
• 제7장 참고문헌 ...40