초록 ▼

연구 목적: 국내에서 시판되는 생명공학의약품은 그 특성이 잘 밝혀져 있음에도 불구하고 제조과정 중에 혼입될 수 있는 발열성 물질의 혼입을 측정하기 위해 토끼를 이용한 발열성시험을 실시하도록 규정되어 있으나 선진국에서는 점차 In vitro 시험법으로 대체하려는 경향이므로 토끼를 이용한 발열성시험과 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) endotoxin 시험법과의 상관관계를 규명하여 불필요한 동물의 사용을 억제하고 endotoxin 시험 시 간섭물질에 대한 영향을 규명하여 선진화된 발열성 시험법의 대체 방안을 제시

연구 목적: 국내에서 시판되는 생명공학의약품은 그 특성이 잘 밝혀져 있음에도 불구하고 제조과정 중에 혼입될 수 있는 발열성 물질의 혼입을 측정하기 위해 토끼를 이용한 발열성시험을 실시하도록 규정되어 있으나 선진국에서는 점차 In vitro 시험법으로 대체하려는 경향이므로 토끼를 이용한 발열성시험과 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) endotoxin 시험법과의 상관관계를 규명하여 불필요한 동물의 사용을 억제하고 endotoxin 시험 시 간섭물질에 대한 영향을 규명하여 선진화된 발열성 시험법의 대체 방안을 제시하고자 본 실험을 실시하였다.
연구 결과: B 형 간염 백신 원료 및 완제품에 endotoxin 을 첨가한 후 토끼 발열성시험을 하였을 때 2.5 endotoxin unit (EU) 에서는 모두 음성 반응을 나타냈으나 5 및 10 EU 에서는 모두 양성반응을 나타내었다. 또한 endotoxin 을 첨가하였을 때 in vitro LAL test 에서도 모두 양성 반응을 나타내어 In vivo 와 In vitro 실험 결과는 상관관계가 있었으며 In vitro 실험법의 감도가 매우 높아서 (0.06 EU/ml 이하) In vivo 실험을 In vitro 실험으로 대체할 수 있음을 확인하였다. 그러나 백신완제품 중에 함유된 알루미늄 겔 Al(OH)3 에 의해 간섭현상이 심하게 나타났으며 알미늄 겔에 의한 간섭을 제거하기 위해서는 filtering 보다는 희석 방법이, kinetic 방법 보다는 겔화법이 더 정확하고, 간편한 방법으로 확인되었다.
연구결과의 활용: 생명공학의약품의 제제기준 및 시험방법의 제정 및 개정을 추진할 수 있는 기반을 구축하여 국제적 위상을 제고하며 토끼 발열성 시험법을 in vitro 방법으로 대체하여 불필요한 동물 희생을 줄이고 경제적이며 과학적인 선진화된 측정방법을 확립할 수 있다. 또한 B 형 간염 백신이외의 다른 생명공학의약품의 발열성시험을 in vitro 시험법으로 대체하여 의약품의 품질관리에 기여할 뿐만 아니라 국민들의 보건복지 향상에도 기여할 것이다.

Abstract ▼

Nature and composition of the biopharmaceuticals comprising recombinant proteins on sale in Korea has been well characterized, however, detection of endotoxin is supposed to comply with the pyrogen test using rabbit to detect contamination of pyrogenic impurities during manufacture. However, in vivo

Nature and composition of the biopharmaceuticals comprising recombinant proteins on sale in Korea has been well characterized, however, detection of endotoxin is supposed to comply with the pyrogen test using rabbit to detect contamination of pyrogenic impurities during manufacture. However, in vivo pyrogen test is being substituted by in vitro test. Therefore, the aim of this study is to evaluate the correlationship between in vivo rabbit test and in vitro LAL test, and to check feasibility of substitution of in vivo test with the in vitro test thereby avoiding animal usage. Furthermore, any intereferences, if any, due to aluminum hydroxide gel, which is added as an adjuvant, and removal of the interference in the in vitro test was monitored for amendment of the in vitro test.
Hepatitis B vaccine and it's active ingredient, hepatitis B surface protein, were supplemented with endotoxin, and subsequently used for determination of pyrogenic activity employing rabbit. Supplementation of 2.5 endotoxin unit (EU) did not increase the body temperature significantly thus indicating negative results, however, supplementation of either 5 or 10 EU increased the body temperature significantly and exhibited positive results. In addition, in vitro LAL test demonstrated that supplementation of endotoxin always exhibited positive results. These results indicate that in vivo and in vitro test have a good correlationship, and in vitro test is much more sensitive (detection limit: < 0.06 EU/ml) than the in vivo test (detection limit: >5 EU) although aluminum hydroxide gel in the hepatitis B vaccine interfered the in vitro LAL test. To remove interference by the aluminum hydroxide, dilution method and filtration method were compared. The results suggest that dilution method is much better than the filtration method, and gel clotting method is more better than the kinetic methods.
Our results could be utilized for improvement and amendment of preparation guidelines and test methods for biopharmaceuticals thereby improving our country's international status in biological tests. Also these results could be used as a basis for substitution of rabbit pyrogen test with in vitro method to avoid unnecessary animal sacrifice, and to secure more economic, scientific, and advanced endotoxin detection. Furthermore, our results could be employed to detect endotoxins in biopharmaceuticals other than hepatitis B vaccine thereby contributing to improvement of quality control and public health.

목차 Contents

• 최종보고서 ...1
• 표지 ...2
• 제출문 ...4
• 요약문 ...5
• Project Summary ...7
• 목차 ...8
• 제1장 서론 ...9
• 가. 연구목적 및 필요성 ...9
• 나. 연구내용 및 범위 ...10
• 제2장 국내.외 기술개발 현황 ...13
• 가. B 형간염 ...13
• 나. 발열성 물질 및 그 특성 ...14
• 다. 발열반응 및 그 기전 ...14
• 라. 발열성물질 측정원리 ...15
• 마. 발열성시험에 대한 국내외 동향 ...19
• 바. B 형 간염 백신의 조성 및 첨가물 ...19
• 제3장 연구개발 수행 내용 및 결과 ...21
• 가. 연구 방법 ...21
• 나. 연구 결과 ...23
• 1) 유전자재조합 B형 간염 백신 완제품 및 원료에 대한 토끼 발열성 시험 ...23
• 2) 유전자재조합 B형 간염 백신 완제품 및 원료에 대한 LAL endotoxin 시험 ...24
• 3) 유전자재조합 B 형간염 백신 원료에 endotoxin을 첨가한 후 발열성 시험과 LAL endotoxin 시험 실시 및 연관성 검토 ...29
• 4) B형 간염 백신에 사용되는 Al(OH)3 가 LAL endotoxin 시험에 미치는 영향 측정 ...31
• 5) Al(OH)3에 의한 간섭현상을 최소화한 LAL test 실험조건 결정 ...31
• 6) 유전자재조합 B형 간염 백신의 LAL endotoxin 시험의 대체 타당성 검토 ...36
• 7) RAW264.7 cell에 LPS를 첨가하여 TNF-α 분비 측정 실험 ...37
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ...38
• 제5장 연구개발결과의 활용성 및 계획 ...39
• 가. 계량적 성과 ...39
• 나. 성과내용기술 ...39
• 다. 활용계획 ...39
• 제6장 기타 중요변경사항 ...40
• 제7장 참고문헌 ...41