초록 ▼

현재 혈장분획제제 최종제품의 국가출하승인을 위해 수행하고 있는 발열성물질시험은 토끼를 이용한 동물시험이다. 그러나 이는 다수의 토끼가 소요되는 시험으로, 3R로 대표되는 동물실험의 최소화를 위해 노력하고 있는 국제적인 추세와 맞지 않는다. 또한 동물의 상태와 시험자의 숙련도에 민감하고 발열물질을 정량할 수 없는 문제점이 있어 점차 축소 및 대체해야할 필요성이 있다.
본 연구과제의 목적은 단핵구활성시험을 이용하여 토끼발열시험의 in vitro 대체시험법을 개발하는 것이다. 이를 위해 식약처를 포함한 세 개 기관에서 사람단핵구활성

현재 혈장분획제제 최종제품의 국가출하승인을 위해 수행하고 있는 발열성물질시험은 토끼를 이용한 동물시험이다. 그러나 이는 다수의 토끼가 소요되는 시험으로, 3R로 대표되는 동물실험의 최소화를 위해 노력하고 있는 국제적인 추세와 맞지 않는다. 또한 동물의 상태와 시험자의 숙련도에 민감하고 발열물질을 정량할 수 없는 문제점이 있어 점차 축소 및 대체해야할 필요성이 있다.
본 연구과제의 목적은 단핵구활성시험을 이용하여 토끼발열시험의 in vitro 대체시험법을 개발하는 것이다. 이를 위해 식약처를 포함한 세 개 기관에서 사람단핵구활성시험에 대한 공동연구를 수행하였고, 토끼단핵구활성시험을 수행하여 토끼발열시험 결과와 비교하였다.
그 결과, 사람단핵구활성시험에서 엔도톡신 및 비엔도톡신성 발열물질인 Lipoteichoic acid와 Peptidoglycan의 농도가 증가함에 따라 발열의 직접적인 원인이 되는 사이토카인 IL-1beta, IL-6, TNF-alpha의 생성량이 비례적으로 증가함을 확인하였고, 토끼발열시험에서의 체온상승 결과와 유사한 경향을 보였다. 토끼단핵구활성시험에서도 엔도톡신과 비엔도톡신성 발열물질인 Lipoteichoic acid의 농도가 증가함에 따라 IL-1beta, IL-6, TNF-alpha 생성량이 비례적으로 증가하였으나, Peptidoglycan에 대해서는 사이토카인 분비가 관찰되지 않았다.
또한, 혈장분획제제 최종제품 4개 품목의 각 1로트에 대해, 3개 발열물질을 농도별로 스파이킹하여 사이토카인 종류별로 회수율을 확인하였다.
본 연구를 통해, 토끼발열시험의 동물대체시험법으로써 단핵구활성시험은 주요발열물질인 엔도톡신 뿐만 아니라, 비엔도톡신성 발열물질의 오염여부를 확인할 수 있음을 확인하였고, 토끼를 이용하는 발열시험을 축소 및 대체하기 위한 근거를 확보하였다.
본 연구결과는 혈액제제의 주요 안전성 항목인 발열성 시험법에 in vitro 시험법을 추가 도입하기 위한 기초자료로 활용될 것이며, 혈액제제 품질관리 향상에 기여할 것으로 기대된다.

Abstract ▼

The rabbit pyrogen test is currently practiced for national lot release of final blood products. While it costs many lives of rabbits, it does not line with the international trend which argues for minimization of animal testing, also represented as 3R. There also has been a need of replacement due

The rabbit pyrogen test is currently practiced for national lot release of final blood products. While it costs many lives of rabbits, it does not line with the international trend which argues for minimization of animal testing, also represented as 3R. There also has been a need of replacement due to its impossibility in quantification of pyrogen, and also to its sensitivity to condition of animals and technique of examinant.
The purpose of this research project is to develop an alternative pyrogen test for national lot release of complete blood products using monocyte activation test. Three organizations including MFDS collaborated for this joint research about human monocyte activation test and we compared the results of monocyte activation test with that of rabbit pyrogen test As a result, we confirmed that the amount of fever inducing cytokines secretion such as IL-1beta, IL-6, TNF-alpha were proportionally increased according to increasing concentration of endotoxin, lipoteichoic acid and peptidoglycan in human monocyte activation test. And the production of cytokines in monocyte activation test and the temperature rise in rabbit pyrogen test showed a similar trend.
In addition, as the concentration of endotoxin and lipoteichoic acid increased, cytokine secretion such as IL-1beta, IL-6, TNF-alpha were also inceased in rabbit monocyte activation test.
However, these cytokines were not secreted by stimulation of peptidoglycan in monocyte activation test using rabbit monocyte.
And also we applied human monocyte activation test to four complete blood products, albumin and intravenous human immunoglobulin for each one lot. And the satisfactory recovery rate of spiked pyrogens in each product was also confirmed.
As an additional alternative pyrogen test, we also performed the basic experiments to review the possibility for the replacement of rabbit pyrogen test to monocyte activation test. We confirm that monocyte activation test can detect not only endotoxin but also non-endotoxin pyrogenes such as Gram positive and fungi origins.
By this research of alternative pyrogen test for national lot release of complete blood products, we predicted substitutability of the rabbit pyrogen test. The results of the research will be used as baseline data for introduction of in vitro pyrogen test which is mainly inspected for safety of blood product, and will also contribute to blood product.