초록 ▼

내열성을 지닌 유전자 재조합 phytase의 생산기술을 개발하기 위하여 기존의 phytase보다 내열성이 높은 phytase를 생산하는 균주를 선발하여 생산된 phytase의 효소적인 특성을 규명하고, phytase 유전자를 확보하여 재조합 효소를 생산하기 위한 발현시스템을 개발함으로써 재조합 효소의대량 생산 기술을 확립하고자 한다. 본 연구개발을 위한 연구개발 내용과 범위는 다음과 같다.

제 1 세부과제에서는 phytase의 특성규명 및 실용화에 관한 연구로;
가. Phytase 생산균주의 분리 및 동정

내열성을 지닌 유전자 재조합 phytase의 생산기술을 개발하기 위하여 기존의 phytase보다 내열성이 높은 phytase를 생산하는 균주를 선발하여 생산된 phytase의 효소적인 특성을 규명하고, phytase 유전자를 확보하여 재조합 효소를 생산하기 위한 발현시스템을 개발함으로써 재조합 효소의대량 생산 기술을 확립하고자 한다. 본 연구개발을 위한 연구개발 내용과 범위는 다음과 같다.

제 1 세부과제에서는 phytase의 특성규명 및 실용화에 관한 연구로;
가. Phytase 생산균주의 분리 및 동정
나. Phytase의 정제방법 확립
다. 정제 효소의 특성분석
다. 가축의 소화효소에 의한 효소의 안정성 측정
라. 재조합 효소의 특성분석

제 2 세부과제에서는 Phytase 대량생산을 위한 발현시스템 개발;
가. 유전자 cloning
나. RT-PCR에 의한 cDNA 제조
다. Phytases 유전자 sequencing 및 분석
라. Phytase 발현 시스템 구축
마. 재조합 효소의 생산

제 3 세부과제에서는 사료원 영양가향상을 위한 발효조건 확립;
가. Phytase 생산을 위한 발효조건 확립
나. 야생주에 의한 사료원의 액상발효조건
다. 야생주를 이용한 고상 발효조건 확립
라. 재조합 효소를 이용한 phytic acid 분해조건

Abstract ▼

Two fungi producing phytase activities were isolated from soil. The fungus secreting highest phytase activity was identified as Aspergille by morphological and cultural characteristics. Isolated fungus producing highest phytase activities was tentatively named Aspergillus sp. 5990 and donated to Kor

Two fungi producing phytase activities were isolated from soil. The fungus secreting highest phytase activity was identified as Aspergille by morphological and cultural characteristics. Isolated fungus producing highest phytase activities was tentatively named Aspergillus sp. 5990 and donated to Korean Collection for Type Cultures (KCTC 8939P). Extracellular phytases produced by Aspergillus sp. 5990 showed a 5-fold higher activity in liquid culture when compared with cultures of Aspergillus ficuum NRRL 3135. The optimum fermentation conditions were determined to be $35^{\circ}C$, neutral pH, and 4 days incubation. The phytase activity was high over 0.1 mM $CaCl_2$ in the medium and that was maximum at the concentration of 0.05% phosphorus in the medium. Degradation of phytate in rice bran by liquid fermentation with Aspergillus sp. 5990 was maximized at the concentration of 10% rice bran in the medium. After 4 days liquid fermentation of rice bran with Aspergillus sp. 5990, total concentration of IP4, IP5, and IP6 was estimated lower than 0.2 mM and the concentration of IP3 was calculated to be 9.1-13.3 mM. The fermentation efficiency of rice bran by Aspergillus sp. 5990 was not affected by fermentation temperature and pH. Degradation of phytate in rice bran by solid fermentation with Aspergillus sp. 5990 was increased with fermentation time and almost phytate was degraded to the derivatives of inositol phosphates after 5 days feremntation. Optimum solid fermentation temperature of rice bran by Aspergillus sp. 5990 was determined to be $25^{\circ}C$ and degradation of phytate was decreased with increment of fermentation temperature. Degradation of phytate in soybean flour by liquid fermentation with Aspergillus sp. 5990 was maximized at the concentration
of 3% soybean flour in the medium. After 3 days of liquid fermentation by Aspergillus sp. 5990, almost phytate in soybean flour was degraded to the derivatives of inositol phosphates. The fermentation efficiency of soybean flour by Aspergillus sp. 5990 was not affected pH, however, that was higher fermentation at $40^{\circ}C$ than at 30 and $35^{\circ}C$. Degradation of phytate in soybean flour by solid fermentation with Aspergillus sp. 5990 was increased with fermentation time and almost phytate was degraded to the derivatives of inositol phosphates after 2 days fermentation. Optimum solid fermentation temperature of soybean flour by Aspergillus sp. 5990 was determined to be $25^{\circ}C$ and degradation of phytate was not affected by initial pH of the medium.

목차 Contents

• 최종보고서 ...1
• 제출문 ...2
• 요약문 ...3
• SUMMARY ...7
• CONTENTS ...10
• 목차 ...17
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ...23
• 제 1 절 연구개발의 목적 ...23
• 제 2 절 연구개발의 필요성 ...23
• 1. 기술적 측면 ...23
• 2. 경제?산업적 측면 ...26
• 3. 사회?문화적 측면 ...27
• 제 3 절 연구개발의 범위 ...29
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ...30
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ...33
• 제1 절 연구개발수행 방법 ...33
• 1. 제 1 세부과제: Phytase의 특성규명 및 실용화...33
• 가. Phytase 생산 균주의 분리 및 동정 ...33
• 1) Phytase 생산 균주의 분리 ...33
• 2) 균주의 분리 및 동정 ...33
• 3) Phytase 생산 균주의 선발 ...34
• 4) 선별균주의 보존 ...34
• 5) 균주의 동정 ...34
• 나. 효소활성 및 단백질 농도측정 ...34
• 1) 단백질 농도측정 ...34
• 2) Phytase 활성 측정 ...35
• 3) Phosphatase 활성의 측정 ...35
• 다. Phytic acid의 정량 ...35
• 라. 균체량 측정...36
• 마. Phytase 생산을 위한 배양조건 ...36
• 1) Phytase 생산을 위한 최적 Ca2+ ion 농도 ...36
• 2) Phytase 생산을 위한 최적 무기인산 농도 ...36
• 3) Phytase 생산을 위한 최적 pH ...36
• 4) Phytase 생산을 위한 최적 온도 ...36
• 5) Phytase 생산을 위한 최적 배양 시간 ...37
• 바. Phytase의 정제 ...37
• 1) Phytase A 정제 ...37
• 2) Phytase B의 정제 ...37
• 사. Phytase의 생화학적 특성 ...38
• 1) 전기영동에 의한 순도검정 및 분자량 결정 ...38
• 2) 활성 최적조건 ...38
• 3) 온도 및 pH 안정성 ...38
• 4) Kinetics constant ...38
• 아. Phytase의 안정성 ...38
• 1) 단위동물의 소화효소에 의한 안정성 ...38
• 2) 부형제에 의한 안정화 ...39
• 2. 제 2세부과제: Phytase 대량생산을 위한 발현시스템 개발 ...39
• 가. 실험균주와 배양조건 ...39
• 나. Genomic DNA의 분리 ...39
• 다. mRNA 분리 ...40
• 라. Phytase 유전자 증폭 ...40
• 마. pBlueScript를 이용한 cloning과 형질전환 ...40
• 바. DNA 분석 ...41
• 사. cDNA 증폭 ...41
• 아. Expression vector의 구축 ...42
• 자. His+ 형질전환체의 선별 ...43
• 차. 형질전환 Pastoris에서 phytase expression ...43
• 3. 제 3 세부과제: 사료원 영양가향상을 위한 발효조건 확립 ...44
• 가. 미강 및 대두박의 분석 ...44
• 1) 일반성분의 분석 ...44
• 2) 무기인의 정량 ...44
• 3) Inositol phosphate의 정량 ...44
• 4) Phytic acid의 정량 ...45
• 5) 균체량 측정 ...45
• 나. 미강 중의 phytic acid 분해를 위한 발효조건 ...45
• 1) 액상 발효에 의한 phytic acid 분해조건 ...45
• 가) 농도에 따른 영향 ...45
• 나) 발효 시간에 따른 영향 ...47
• 다) 발효 온도에 따른 영향 ...47
• 라) 발효 pH에 따른 영향 ...47
• 2) 고상 발효에 의한 미강 중의 phytic acid 분해조건 ...47
• 가) 발효 시간에 따른 영향 ...47
• 나) 발효 온도에 따른 영향 ...48
• 다. 대두박 중의 phytic acid 분해를 위한 발효조건 ...48
• 1) 액상 발효에 의한 phytic acid 분해조건 ...48
• 가) 농도에 따른 영향 ...48
• 나) 발효 시간에 따른 영향 ...48
• 다) 발효 온도에 따른 영향 ...48
• 라) 발효 pH에 따른 영향 ...49
• 2) 고상 발효에 의한 phytic acid 분해조건 ...49
• 가) 발효 시간에 따른 영향 ...49
• 나) 발효 온도에 따른 영향 ...49
• 라. 미강과 대두박 중의 phytic acid 분해를 위한 효소반응조건 ...49
• 1) 미강 중의 phytic acid 분해를 위한 효소반응조건 ...49
• 2) 대두박 중의 phytic acid 분해를 위한 효소반응조건 ...50
• 제 2 절 연구개발수행 결과 ...50
• 1. 제1 세부과제 : Phytase의 특성규명 및 실용화 ...50
• 가. Phytase 생산균의 분리 및 특성 ...50
• 1) Phytase 생산균의 분리 ...50
• 2) Phytase 생산균의 동정 ...50
• 나. Phytase 정제 ...51
• 1) Phytase의 생산 ...51
• 2) Phytase의 정제 ...51
• 가) Phytase A 정제 ...51
• 나) Phytase B 정제 ...55
• 다. 정제효소의 특성 분석 ...65
• 1) 분자량 결정 ...65
• 2) 반응최적 pH ...68
• 3) 최적 온도 ...69
• 4) 내열성 ...69
• 5) 동력학적 특성 ...73
• 6) 기질특이성 ...76
• 7) Deglycosylation에 따른 활성 및 분자량 변화 ...76
• 라. Polyclonal antibody 생산 ...79
• 마. 소화효소 공존시 phytase 활성 ...83
• 1) 미강 phytin 분해에 대한 단백질분해효소의 영향 ...83
• 2) 대두박 phytin 분해에 대한 단백질분해효소의 영향 ...84
• 바. 효소의 안정성 ...87
• 1) 가축의 소화효소에 의한 효소의 안정성 ...87
• 2) 조효소의 저장안정성 ...88
• 3) 건조, 제제화 기술 확립 ...96
• 가) 열풍건조법 ...98
• 나) 냉풍건조법 ...98
• 다) 분무건조법 ...98
• 라) 동결건조법 ...99
• 마) 경제성 비교 검토 ...99
• 바) 건조 제제 특성 ...99
• 2. 제 2세부과제: Phytase 대량생산을 위한 발현시스템 개발 ...100
• 가. Aspergillus sp. 5990 phytase 유전자 cloning ...101
• 나. cDNA 증폭 ...101
• 다. Multiple integration을 위한 발현 벡터 구축 ...104
• 라. Aspergillus sp. 5990 PhyA 유전자 분석...109
• 마. Phytase 생산용 Pichia pastoris 형질전환체의 분석...109
• 바. 재조합 phytase 대량생산...111
• 사. 재조합, 야생형 및 시판용 phytase의 정제...111
• 1) Phytase의 정제 ...111
• 가) 야생형 phytase A의 정제 ...113
• 나) BASF phytase의 정제 ...117
• 다) 재조합 phytase의 정제 ...117
• 아. 재조합 정제효소의 특성 ...120
• 1) Glycosylation 정도 ...120
• 2) 재조합 정제효소의 반응최적 조건 ...123
• 3) 재조합 정제효소의 내열성 ...128
• 4) 재조합 정제효소의 기질 특이성 ...130
• 5) 재조합 정제효소의 kinetics ...132
• 3. 제3 세부과제: 사료원 영양가향상을 위한 발효조건 확립 ...135
• 가. Phytase 생산을 위한 배양조건 ...135
• 1) Phytase 생산을 위한 최적 Ca2+ ion 농도 ...135
• 2) Phytase 생산을 위한 최적 무기인산 농도 ...135
• 3) Phytase 생산을 위한 최적 pH ...139
• 4) Phytase 생산을 위한 최적 온도 ...139
• 5) Phytase 생산을 위한 최적 배양 시간 ...143
• 나. 미강 중의 phytic acid 분해를 위한 발효조건 ...143
• 1) 미강의 일반성분 분석 ...143
• 2) 액상 발효에 의한 미강 중의 phytic acid 분해조건 ...143
• 다. 고체 발효에 의한 미강 중의 phytic acid 분해조건 ...148
• 1) 발효 시간에 따른 영향 ...148
• 2) 발효 온도에 따른 영향 ...152
• 라. 대두박 중의 phytic acid 분해를 위한 발효조건 ...152
• 1) 대두박의 일반성분 분석 ...152
• 2) 액상 발효에 의한 대두박 중의 phytic acid 분해조건 ...152
• 가) 농도에 따른 영향 ...152
• 나) 발효 시간에 따른 영향 ...153
• 다) 발효 온도에 따른 영향 ...158
• 라) 발효 pH에 따른 영향 ...158
• 3) 고상 발효에 의한 대두박 중의 phytic acid 분해조건 ...158
• 가) 발효 시간에 따른 영향 ...158
• 나) 발효 온도에 따른 영향 ...162
• 마. 효소를 이용한 곡류 부산물중의 phytic acid의 분해조건 ...162
• 1) Phytase 농도의 영향 ...162
• 2) pH의 영향 ...163
• 3) 온도의 영향 ...167
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...169
• 제 1절 1차년도 연구개발 목표 ...169
• 1. 제 1 세부과제 Phytase의 특성규명 및 실용화 ...169
• 가. Phytase 생산균주의 분리 및 동정 ...169
• 나. Phytases의 정제방법 확립 ...169
• 다. 정제 효소의 특성분석 ...170
• 1) 분자량 ...170
• 2) 최적 반응 pH ...170
• 3) 최적 반응 온도 ...170
• 4) 내열성 ...171
• 5) 동력학적 특성 ...171
• 6) 기질특이성 ...171
• 2. 제 2 세부과제 Phytase 대량생산을 위한 발현시스템 개발 ...171
• 가. 유전자 cloning ...171
• 나. RT-PCR에 의한 cDNA 제조 ...172
• 다. Phytases 유전자 sequencing 및 분석 ...172
• 3. 제 3 세부과제 사료원 영양가향상을 위한 발효조건 확립 ...173
• 가. Phytase 생산을 위한 발효조건 확립 ...173
• 나. 야생주에 의한 사료원의 액상발효조건 ...173
• 1) 액상 발효에 의한 미강 중의 phytin 분해조건 ...173
• 가) 미강 농도에 따른 영향 ...173
• 나) 발효 시간에 따른 영향 ...174
• 다) 발효 온도에 따른 영향 ...174
• 라) 발효 pH에 따른 영향 ...174
• 2) 액상 발효에 의한 대두박 중의 phytin 분해조건 ...174
• 가) 대두박 농도에 따른 영향 ...174
• 나) 발효 시간에 따른 영향 ...175
• 다) 발효 온도에 따른 영향 ...175
• 라) 발효 pH에 따른 영향 ...175
• 제 2절 2차 년도 연구개발 목표 ...175
• 1. 제 1 세부과제 Phytase의 특성규명 및 실용화 ...176
• 가. Deglycosylation에 따른 활성 및 분자량 변화 ...176
• 나. Polyclonal antibody 생산 ...176
• 다. 소화효소 공존시 phytin 분해능 ...176
• 1) 미강 phytin 분해에 대한 단백질분해효소의 영향 ...176
• 2) 대두박 phytin 분해에 대한 단백질분해효소의 영향 ...177
• 라. 효소의 안정성 ...177
• 1) 가축의 소화효소에 의한 효소의 안정성 ...177
• 2) 조효소의 저장안정성 ...177
• 3) 건조, 제제화 기술 확립 ...178
• 4) 건조 제제 특성 ...178
• 2. 제 2 세부과제 Phytase 대량생산을 위한 발현시스템 개발 ...179
• 가. Phytase 발현 시스템 구축 ...179
• 나. 재조합 효소의 생산 ...179
• 다. 재조합효소의 특성분석 ...180
• 1) Glycosylation 정도 ...180
• 2) 재조합 정제효소의 반응최적 조건 ...180
• 3) 재조합 정제효소의 내열성 ...180
• 4) 재조합 정제효소의 기질 특이성 ...181
• 5) 재조합 정제효소의 kinetics ...181
• 3. 제 3 세부과제 사료원 영양가향상을 위한 발효조건 확립 ...181
• 가. 야생주를 이용한 고상 발효조건 확립 ...181
• 1) 고체 발효에 의한 미강 중의 phytic acid 분해조건 ...181
• 가) 발효 시간에 따른 영향 ...181
• 나) 발효 온도에 따른 영향 ...182
• 2) 고상 발효에 의한 대두박 중의 phytic acid 분해조건 ...182
• 가) 발효 시간에 따른 영향 ...182
• 나) 발효 온도에 따른 영향 ...182
• 나. 재조합 효소를 이용한 phytic acid 분해조건 ...182
• 1) Phytase 농도의 영향 ...182
• 2) pH의 영향 ...183
• 3) 온도의 영향 ...183
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ...184
• 1. 추가연구의 필요성 ...184
• 2. 타연구에의 응용 ...184
• 3. 기업화 추진방향 ...184
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ...186
• 제 7 장 참고문헌 ...187