초록 ▼

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
본 연구개발결과 Aspergillus sp. 5990이 생산하는 phytase는 기존의 Aspergillus ficcum NRRL 3135균이 산생하는 효소보다 최적온도가 7-10℃ 가량 높은 것으로 평가되었으며, 내열성 또한 기존의 phytase에 비해 높은 것으로 평가되었다. 그리고 본 연구개발에서 phytase를 대량생산하기 위한 유전자 확보 및 생산조건을 확보하였으므로 생산시설에 적합한 생산조건을 확립함으로써 대량생산은 용이하게 달성될 수 있다. 그리고 본 연구개발에서 확립된 p

Ⅳ. 연구개발 결과 및 활용에 대한 건의
본 연구개발결과 Aspergillus sp. 5990이 생산하는 phytase는 기존의 Aspergillus ficcum NRRL 3135균이 산생하는 효소보다 최적온도가 7-10℃ 가량 높은 것으로 평가되었으며, 내열성 또한 기존의 phytase에 비해 높은 것으로 평가되었다. 그리고 본 연구개발에서 phytase를 대량생산하기 위한 유전자 확보 및 생산조건을 확보하였으므로 생산시설에 적합한 생산조건을 확립함으로써 대량생산은 용이하게 달성될 수 있다. 그리고 본 연구개발에서 확립된 phytase의 신속한 정제방법은 앞으로 다른 phytase의 정제에 용이하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다
현재 phytase의 시장이 최근 2-3년간 정체되어 있으므로 현재 상황으로는 새로운 상표로 이미 형성된 시장에 진입하여 기존 제품과 경쟁하기에는 어려운 점이 많을 것으로 예상된다. 그러나 향후 환경 문제와 더불어 phytase 시장이 급속히 성장하리라 예상되기 때문에 현재의 시장보다는 미래 시장을 예측하여 기술을 확보하여 산업화에 대비하는 것이 바람직할 것으로 판단된다. 그리고 현재까지 다수의 논문을 발표하였으며, 외국학회지를 통한 발표로써 본 연구개발의 효과를 국제적으로 홍보할 수 있는 기회가 올 것으로 기대된다.
본 연구개발에서는 실험실적으로 대량생산방법이 확립되었으며, 앞으로 기업체에서 대량생산하기 위하여 보다 pilot 규모 또는 plant 규모의 발효조건확립이 필요하다. 이러한 2차적인 연구는 본 연구진에 의하여 기술을 이전할 계획이다.

Abstract ▼

Two fungi producing phytase activities were isolated from soil. The fungus secreting highest phytase activity was identified as Aspergille by morphological and cultural characteristics. Isolated fungus producing highest phytase activities was tentatively named Aspergillus sp. 5990 and donated to Kor

Two fungi producing phytase activities were isolated from soil. The fungus secreting highest phytase activity was identified as Aspergille by morphological and cultural characteristics. Isolated fungus producing highest phytase activities was tentatively named Aspergillus sp. 5990 and donated to Korean Collection for Type Cultures (KCTC 8939P). Extracellular phytases produced by Aspergillus sp. 5990 showed a 5-fold higher activity in liquid culture when compared with cultures of Aspergillus ficuum NRRL 3135. The optimum fermentation conditions were determined to be $35^{\circ}C$, neutral pH, and 4 days incubation. The phytase activity was high over 0.1 mM $CaCl_2$ in the medium and that was maximum at the concentration of 0.05% phosphorus in the medium. Degradation of phytate in rice bran by liquid fermentation with Aspergillus sp. 5990 was maximized at the concentration of 10% rice bran in the medium. After 4 days liquid fermentation of rice bran with Aspergillus sp. 5990, total concentration of IP4, IP5, and IP6 was estimated lower than 0.2 mM and the concentration of IP3 was calculated to be 9.1-13.3 mM. The fermentation efficiency of rice bran by Aspergillus sp. 5990 was not affected by fermentation temperature and pH. Degradation of phytate in rice bran by solid fermentation with Aspergillus sp. 5990 was increased with fermentation time and almost phytate was degraded to the derivatives of inositol phosphates after 5 days feremntation. Optimum solid fermentation temperature of rice bran by Aspergillus sp. 5990 was determined to be $25^{\circ}C$ and degradation of phytate was decreased with increment of fermentation temperature. Degradation of phytate in soybean flour by liquid fermentation with Aspergillus sp. 5990 was maximized at the concentration
of 3% soybean flour in the medium. After 3 days of liquid fermentation by Aspergillus sp. 5990, almost phytate in soybean flour was degraded to the derivatives of inositol phosphates. The fermentation efficiency of soybean flour by Aspergillus sp. 5990 was not affected pH, however, that was higher fermentation at $40^{\circ}C$ than at 30 and $35^{\circ}C$. Degradation of phytate in soybean flour by solid fermentation with Aspergillus sp. 5990 was increased with fermentation time and almost phytate was degraded to the derivatives of inositol phosphates after 2 days fermentation. Optimum solid fermentation temperature of soybean flour by Aspergillus sp. 5990 was determined to be $25^{\circ}C$ and degradation of phytate was not affected by initial pH of the medium.
Extracellular phytases from Aspergillus niger var. awamori were purified to homogeneity using Q-Sepharose, S-Sepharose and Mono-S column. Purities of phytase A and B increased 19.7- and 26.5-fold with approximately 66 and 56.2% yield, respectively. The molecular weights of phytase A and B were estimated to be 84 and 74 kDa, respectively, by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and 98 and 330 kDa using Superose 6 gel filtration. The phytase A showed maximum activity at pH 5.5 with a second activity peak occurring at pH 2.8 and maximum activity of phytase B showed at pH 3.0. Optimum temperature of both enzymes was 65℃. The phytase A was stable up to heat treatment at 65℃ for 30 min and phytase B displayed considerably higher thermostability than phytase A and commercial phytase. Phytase A has high activity for sodium phytate and less activities on other phosphorylated compounds and phytase B displays rather broad substrate specificity at pH 2.5 but low activity with sodium phytate. The apparent Michaelis-Menten (Km) constants and substrate turnover numbers (Vmax) of phytase A were determined to be 1.20 mM and 6,800 sec-1 at pH 2.5 and 0.37 mM and 2,200 sec-1, respectively, at pH 5.5. The Km value and Vmax of phytase B were estimated to be 0.29 mM and 2,100 sec-1, respectively, at pH 2.5 and 37℃. The residual activities of the phytase A and B were determined at pH 5.5 for phytase A and at pH 2.5 for phytase B at 37℃ after deglycosylation. Phytase A activity decreased to 80% of the original activity by deglycosylation, however, phytase B was not changed by deglycosylation, which suggested that activity of phytase B was not affected by glycosylation. Antibody of phytase A recognized only phytase without cross-reaction with phytase B, which supports the antibody has high specificity. However, antibody of phytase B reacted with phytase A as well as phytase A that gives a possibility the phytase A and B have a structural simility in epitope region of phytase B antibody. Degradation of phytic acid was highest in the pH range of 4.5-5.5 in both
The objectives were to isolate thermostable phytase and express the phytase gene in methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Extracellular phytase produced by Aspergillus sp. 5990 showed a 5-fold higher activity in liquid culture when compared with culture of Aspergillus ficcum NRRL 3135. Further analysis, Aspergillus sp. 5990 was identified as Aspergillus niger var. awamori. Based on N-terminal sequencing data, mRNA was isolated and amplified using RT-PCR. The gene (1.4kb) was inserted into an expression vector pPIC9K with a signal peptide α-factor, under control of AOX1 promoter. The resulting plasmid was electrotransformed into two P. pastoris strains: KM71 and GS115. Expressed and wild type phytase and commercial phytase from BASF were purified to homogeneity using two ionic exchange chromatographic steps. SDS-PAGE shows that wild-type phytase from Aspergillus sp. 5990 was highly glycosylated than two others while deglycosylated form of three phytase were same as 49 KD. Sequence homology of these phytase was almost same as 99% but thermostability of phytase from Aspergillus sp. 5990 relatively high than others. In conclusion, glycosylation plays in a key roll of thermostability of phytase and its enzymatic characterization.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 10
• 목차 ... 17
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 23
• 제 1 절 연구개발의 목적 ... 23
• 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 23
• 1. 기술적 측면 ... 23
• 2. 경제·산업적 측면 ... 26
• 3. 사회·문화적 측면 ... 27
• 제 3 절 연구개발의 범위 ... 29
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 30
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 33
• 제1 절 연구개발수행 방법 ... 33
• 1. 제 1 세부과제: Phytase의 특성규명 및 실용화 ... 33
• 가. Phytase 생산 균주의 분리 및 동정 ... 33
• 1) Phytase 생산 균주의 분리 ... 33
• 2) 균주의 분리 및 동정 ... 33
• 3) Phytase 생산 균주의 선발 ... 34
• 4) 선별균주의 보존 ... 34
• 5) 균주의 동정 ... 34
• 나. 효소활성 및 단백질 농도측정 ... 34
• 1) 단백질 농도측정 ... 34
• 2) Phytase 활성 측정 ... 35
• 3) Phosphatase 활성의 측정 ... 35
• 다. Phytic acid의 정량 ... 35
• 라. 균체량 측정 ... 36
• 마. Phytase 생산을 위한 배양조건 ... 36
• 1) Phytase 생산을 위한 최적 Ca2+ ion 농도 ... 36
• 2) Phytase 생산을 위한 최적 무기인산 농도 ... 36
• 3) Phytase 생산을 위한 최적 pH ... 36
• 4) Phytase 생산을 위한 최적 온도 ... 36
• 5) Phytase 생산을 위한 최적 배양 시간 ... 37
• 바. Phytase의 정제 ... 37
• 1) Phytase A 정제 ... 37
• 2) Phytase B의 정제 ... 37
• 사. Phytase의 생화학적 특성 ... 38
• 1) 전기영동에 의한 순도검정 및 분자량 결정 ... 38
• 2) 활성 최적조건 ... 38
• 3) 온도 및 pH 안정성 ... 38
• 4) Kinetics constant ... 38
• 아. Phytase의 안정성 ... 38
• 1) 단위동물의 소화효소에 의한 안정성 ... 38
• 2) 부형제에 의한 안정화 ... 39
• 2. 제 2세부과제: Phytase 대량생산을 위한 발현시스템 개발 ... 39
• 가. 실험균주와 배양조건 ... 39
• 나. Genomic DNA의 분리 ... 39
• 다. mRNA 분리 ... 40
• 라. Phytase 유전자 증폭 ... 40
• 마. pBlueScript를 이용한 cloning과 형질전환 ... 40
• 바. DNA 분석 ... 41
• 사. cDNA 증폭 ... 41
• 아. Expression vector의 구축 ... 42
• 자. His+ 형질전환체의 선별 ... 43
• 차. 형질전환 Pastoris에서 phytase expression ... 43
• 3. 제 3 세부과제: 사료원 영양가향상을 위한 발효조건 확립 ... 44
• 가. 미강 및 대두박의 분석 ... 44
• 1) 일반성분의 분석 ... 44
• 2) 무기인의 정량 ... 44
• 3) Inositol phosphate의 정량 ... 44
• 4) Phytic acid의 정량 ... 45
• 5) 균체량 측정 ... 45
• 나. 미강 중의 phytic acid 분해를 위한 발효조건 ... 45
• 1) 액상 발효에 의한 phytic acid 분해조건 ... 45
• 가) 농도에 따른 영향 ... 45
• 나) 발효 시간에 따른 영향 ... 47
• 다) 발효 온도에 따른 영향 ... 47
• 라) 발효 pH에 따른 영향 ... 47
• 2) 고상 발효에 의한 미강 중의 phytic acid 분해조건 ... 47
• 가) 발효 시간에 따른 영향 ... 47
• 나) 발효 온도에 따른 영향 ... 48
• 다. 대두박 중의 phytic acid 분해를 위한 발효조건 ... 48
• 1) 액상 발효에 의한 phytic acid 분해조건 ... 48
• 가) 농도에 따른 영향 ... 48
• 나) 발효 시간에 따른 영향 ... 48
• 다) 발효 온도에 따른 영향 ... 48
• 라) 발효 pH에 따른 영향 ... 49
• 2) 고상 발효에 의한 phytic acid 분해조건 ... 49
• 가) 발효 시간에 따른 영향 ... 49
• 나) 발효 온도에 따른 영향 ... 49
• 라. 미강과 대두박 중의 phytic acid 분해를 위한 효소반응조건 ... 49
• 1) 미강 중의 phytic acid 분해를 위한 효소반응조건 ... 49
• 2) 대두박 중의 phytic acid 분해를 위한 효소반응조건 ... 50
• 제 2 절 연구개발수행 결과 ... 50
• 1. 제1 세부과제 : Phytase의 특성규명 및 실용화 ... 50
• 가. Phytase 생산균의 분리 및 특성 ... 50
• 1) Phytase 생산균의 분리 ... 50
• 2) Phytase 생산균의 동정 ... 50
• 나. Phytase 정제 ... 51
• 1) Phytase의 생산 ... 51
• 2) Phytase의 정제 ... 51
• 가) Phytase A 정제 ... 51
• 나) Phytase B 정제 ... 55
• 다. 정제효소의 특성 분석 ... 65
• 1) 분자량 결정 ... 65
• 2) 반응최적 pH ... 68
• 3) 최적 온도 ... 69
• 4) 내열성 ... 69
• 5) 동력학적 특성 ... 73
• 6) 기질특이성 ... 76
• 7) Deglycosylation에 따른 활성 및 분자량 변화 ... 76
• 라. Polyclonal antibody 생산 ... 79
• 마. 소화효소 공존시 phytase 활성 ... 83
• 1) 미강 phytin 분해에 대한 단백질분해효소의 영향 ... 83
• 2) 대두박 phytin 분해에 대한 단백질분해효소의 영향 ... 84
• 바. 효소의 안정성 ... 87
• 1) 가축의 소화효소에 의한 효소의 안정성 ... 87
• 2) 조효소의 저장안정성 ... 88
• 3) 건조, 제제화 기술 확립 ... 96
• 가) 열풍건조법 ... 98
• 나) 냉풍건조법 ... 98
• 다) 분무건조법 ... 98
• 라) 동결건조법 ... 99
• 마) 경제성 비교 검토 ... 99
• 바) 건조 제제 특성 ... 99
• 2. 제 2세부과제: Phytase 대량생산을 위한 발현시스템 개발 ... 100
• 가. Aspergillus sp. 5990 phytase 유전자 cloning ... 101
• 나. cDNA 증폭 ... 101
• 다. Multiple integration을 위한 발현 벡터 구축 ... 104
• 라. Aspergillus sp. 5990 PhyA 유전자 분석 ... 109
• 마. Phytase 생산용 Pichia pastoris 형질전환체의 분석 ... 109
• 바. 재조합 phytase 대량생산 ... 111
• 사. 재조합, 야생형 및 시판용 phytase의 정제 ... 111
• 1) Phytase의 정제 ... 111
• 가) 야생형 phytase A의 정제 ... 113
• 나) BASF phytase의 정제 ... 117
• 다) 재조합 phytase의 정제 ... 117
• 아. 재조합 정제효소의 특성 ... 120
• 1) Glycosylation 정도 ... 120
• 2) 재조합 정제효소의 반응최적 조건 ... 123
• 3) 재조합 정제효소의 내열성 ... 128
• 4) 재조합 정제효소의 기질 특이성 ... 130
• 5) 재조합 정제효소의 kinetics ... 132
• 3. 제3 세부과제: 사료원 영양가향상을 위한 발효조건 확립 ... 135
• 가. Phytase 생산을 위한 배양조건 ... 135
• 1) Phytase 생산을 위한 최적 Ca2+ ion 농도 ... 135
• 2) Phytase 생산을 위한 최적 무기인산 농도 ... 135
• 3) Phytase 생산을 위한 최적 pH ... 139
• 4) Phytase 생산을 위한 최적 온도 ... 139
• 5) Phytase 생산을 위한 최적 배양 시간 ... 143
• 나. 미강 중의 phytic acid 분해를 위한 발효조건 ... 143
• 1) 미강의 일반성분 분석 ... 143
• 2) 액상 발효에 의한 미강 중의 phytic acid 분해조건 ... 143
• 라. 고체 발효에 의한 미강 중의 phytic acid 분해조건 ... 148
• 1) 발효 시간에 따른 영향 ... 148
• 2) 발효 온도에 따른 영향 ... 152
• 라. 대두박 중의 phytic acid 분해를 위한 발효조건 ... 152
• 1) 대두박의 일반성분 분석 ... 152
• 2) 액상 발효에 의한 대두박 중의 phytic acid 분해조건 ... 152
• 가) 농도에 따른 영향 ... 152
• 나) 발효 시간에 따른 영향 ... 153
• 다) 발효 온도에 따른 영향 ... 158
• 라) 발효 pH에 따른 영향 ... 158
• 3) 고상 발효에 의한 대두박 중의 phytic acid 분해조건 ... 158
• 가) 발효 시간에 따른 영향 ... 158
• 나) 발효 온도에 따른 영향 ... 162
• 마. 효소를 이용한 곡류 부산물중의 phytic acid의 분해조건 ... 162
• 1) Phytase 농도의 영향 ... 162
• 2) pH의 영향 ... 163
• 3) 온도의 영향 ... 167
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 169
• 제 1절 1차년도 연구개발 목표 ... 169
• 1. 제 1 세부과제 Phytase의 특성규명 및 실용화 ... 169
• 가. Phytase 생산균주의 분리 및 동정 ... 169
• 나. Phytases의 정제방법 확립 ... 169
• 다. 정제 효소의 특성분석 ... 170
• 1) 분자량 ... 170
• 2) 최적 반응 pH ... 170
• 3) 최적 반응 온도 ... 170
• 4) 내열성 ... 171
• 5) 동력학적 특성 ... 171
• 6) 기질특이성 ... 171
• 2. 제 2 세부과제 Phytase 대량생산을 위한 발현시스템 개발 ... 171
• 가. 유전자 cloning ... 171
• 나. RT-PCR에 의한 cDNA 제조 ... 172
• 다. Phytases 유전자 sequencing 및 분석 ... 172
• 3. 제 3 세부과제 사료원 영양가향상을 위한 발효조건 확립 ... 173
• 가. Phytase 생산을 위한 발효조건 확립 ... 173
• 나. 야생주에 의한 사료원의 액상발효조건 ... 173
• 1) 액상 발효에 의한 미강 중의 phytin 분해조건 ... 173
• 가) 미강 농도에 따른 영향 ... 173
• 나) 발효 시간에 따른 영향 ... 174
• 다) 발효 온도에 따른 영향 ... 174
• 라) 발효 pH에 따른 영향 ... 174
• 2) 액상 발효에 의한 대두박 중의 phytin 분해조건 ... 174
• 가) 대두박 농도에 따른 영향 ... 174
• 나) 발효 시간에 따른 영향 ... 175
• 다) 발효 온도에 따른 영향 ... 175
• 라) 발효 pH에 따른 영향 ... 175
• 제 2절 2차 년도 연구개발 목표 ... 175
• 1. 제 1 세부과제 Phytase의 특성규명 및 실용화 ... 176
• 가. Deglycosylation에 따른 활성 및 분자량 변화 ... 176
• 나. Polyclonal antibody 생산 ... 176
• 다. 소화효소 공존시 phytin 분해능 ... 176
• 1) 미강 phytin 분해에 대한 단백질분해효소의 영향 ... 176
• 2) 대두박 phytin 분해에 대한 단백질분해효소의 영향 ... 177
• 라. 효소의 안정성 ... 177
• 1) 가축의 소화효소에 의한 효소의 안정성 ... 177
• 2) 조효소의 저장안정성 ... 177
• 3) 건조, 제제화 기술 확립 ... 178
• 4) 건조 제제 특성 ... 178
• 2. 제 2 세부과제 Phytase 대량생산을 위한 발현시스템 개발 ... 179
• 가. Phytase 발현 시스템 구축 ... 179
• 나. 재조합 효소의 생산 ... 179
• 다. 재조합효소의 특성분석 ... 180
• 1) Glycosylation 정도 ... 180
• 2) 재조합 정제효소의 반응최적 조건 ... 180
• 3) 재조합 정제효소의 내열성 ... 180
• 4) 재조합 정제효소의 기질 특이성 ... 181
• 5) 재조합 정제효소의 kinetics ... 181
• 3. 제 3 세부과제 사료원 영양가향상을 위한 발효조건 확립 ... 181
• 가. 야생주를 이용한 고상 발효조건 확립 ... 181
• 1) 고체 발효에 의한 미강 중의 phytic acid 분해조건 ... 181
• 가) 발효 시간에 따른 영향 ... 181
• 나) 발효 온도에 따른 영향 ... 182
• 2) 고상 발효에 의한 대두박 중의 phytic acid 분해조건 ... 182
• 가) 발효 시간에 따른 영향 ... 182
• 나) 발효 온도에 따른 영향 ... 182
• 나. 재조합 효소를 이용한 phytic acid 분해조건 ... 182
• 1) Phytase 농도의 영향 ... 182
• 2) pH의 영향 ... 183
• 3) 온도의 영향 ... 183
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 184
• 1. 추가연구의 필요성 ... 184
• 2. 타연구에의 응용 ... 184
• 3. 기업화 추진방향 ... 184
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 186
• 제 7 장 참고문헌 ... 187
• 끝페이지 ... 191