초록 ▼

o 느타리버섯 자실체 형성관련 돌연변이체 선발 및 변이의 원인유전자 분석
ㆍ느타리버섯의 REMI (Restriction Enzyme Mediated Integration) 형질전환 방법에 의한 tagging mutant의 대량 선발.
ㆍ전통적인 U.V mutagenesis에 의한 돌연변이체의 대량 선발.
ㆍ병 재배에 의한 돌연변이체의 자실체 유기법의 확립과 자실체 및 균사체의 특성조사.
ㆍ느타리버섯 tagging mutant로부터 plasmid rescue에 의한 표현형 관련 유용형질 유전자의 분리.
ㆍ자

o 느타리버섯 자실체 형성관련 돌연변이체 선발 및 변이의 원인유전자 분석
ㆍ느타리버섯의 REMI (Restriction Enzyme Mediated Integration) 형질전환 방법에 의한 tagging mutant의 대량 선발.
ㆍ전통적인 U.V mutagenesis에 의한 돌연변이체의 대량 선발.
ㆍ병 재배에 의한 돌연변이체의 자실체 유기법의 확립과 자실체 및 균사체의 특성조사.
ㆍ느타리버섯 tagging mutant로부터 plasmid rescue에 의한 표현형 관련 유용형질 유전자의 분리.
ㆍ자실체 형태 및 품질관련 유용한 변이체의 원인유전자 기능분석 및 육종 소재화.
o 자실체의 발생단계별 특이발현 유전자의 염기서열 결정 및 발현양상 분석
ㆍ돌연변이처리용 모본으로 설정한 균주의 자실체 발생단계별 cDNA library의 제작과 total RNA의 대량 분리.
ㆍcDNA Random sequencing에 의한 자실체 발생단계별 특이발현 유전자의 분리.
ㆍReverse northern blot에 의한 특이발현 유전자의 분리 및 발생단계별 발현양상 분석.
ㆍ특이발현 cDNA를 probe로 이용한 genomic clone의 선발 및 염기서열의 결정과 구조분석
ㆍ상동성 검색 및 구조분석에 의한 기능 유추.
o 자실체 형성관련 유전자와 표현형과의 관련성 분석 및 육종소재에의 이용개발
ㆍ돌연변이 원인유전자와 특이발현 유전자의 상동성 및 구조분석.
ㆍ유전자 결손과 과리발현의 형질전환체 생산을 위한 재조합 vector 제작.
ㆍ유전자 결손 및 과리발현 형질전화체 제작.
ㆍ형질전환체의 자실체 특성 규명에 의한 유전자의 기능 해석.
ㆍ유용형질관련 유전자 및 형질전환체의 육종소재로 이용.

Abstract ▼

A. The examination of condition for mutagenesis and mutants isolation
1) built up the transformation system by REMI transformation of P.ostreatus.
2) examine the condition of UV mutagenesis.
3) isolate mutant strain.
4) characterize the mushroom traits of mutant strains.
5) select the

A. The examination of condition for mutagenesis and mutants isolation
1) built up the transformation system by REMI transformation of P.ostreatus.
2) examine the condition of UV mutagenesis.
3) isolate mutant strain.
4) characterize the mushroom traits of mutant strains.
5) select the strain for the strain improvement.
The REMI transformation system will be examined ura3 gene in uracil auxotrophs. But we will tried to develop the system using the antibiotics resistance gene. The new strain isolated by mutagenesis will be prepared for stain improvement in P.ostreatus
B. Gene expression profile and EST analysis of Pleurotus ostreatus
1) construct cDNA libraries of eight developmental stages.
2) analyse EST by cDNA random sequencing.
3) search the homology of ESTs by BLAST program.
4) construct the gene expression profile during fruiting by reverse northern.
5) screening the stage specific genes
The cDNA database will be constructed by using the EST results. This database will be contained the functional categories classified by yeast database. All data will be submitted to any researcher to use for the studies of P. ostreatus.
C. Differential gene expression during the developmental stages
1) Select the specifically expressed genes from EST analysis.
2) Isolate full length cDNA of fruit body specific gene by RACE method.
3) Analyse the gene expression in fruiting by northern blot, quantitative RT-PCR or Real-time PCR.
After analysing expression pattern of selected genes, we will isolate the most specific gene for fruit body formation in P. ostreatus. Full length cDNA of this gene will be constructed with over- expressing vector to be transformed into P. ostreatus.
D. Functional analysis of specific genes by the over-expression in P. ostreatus.
1) prepare the cassette vector for over-expressing gene by using beta tubulin promoter and terminator of P. ostreatus.
2) construct the over-expressing vector by recombination of specific cDNA into cassette vector.
3) prepare the host strain, which have homothallic character to be necessary for developing transgenic fruiting bodies without mating.
4) transform host strain by integrating the over-expressing recombinant vector.
5) analyse the gene expression level and the fruiting phenotype of transgenic mushroom.
The function of specific fruiting gene will be able to be suggested by analysing the gene expression and the phenotype of transgenic mushrooms.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문 ...2
• 요약문 ...3
• SUMMARY ...9
• CONTENTS ...17
• 목차 ...19
• 제1장 연구개발과제의 개요 ...23
• 1. 버섯연구의 중요성 ...23
• 가. 농업분야의 국제경쟁력 ...23
• 나. 버섯분야의 국제경쟁력 ...23
• 2. 버섯의 가치 ...24
• 가. 버섯은 유일한 작물성 미생물 ...24
• 나. 버섯의 인체 효능 ...24
• 3. 버섯 재배기술의 발전과정 ...25
• 4. 버섯 연구의 필요성 ...26
• 가. 한국형 고부가성 재배작물 ...26
• 나. 경제적 중요성 ...26
• 다. 사회적 중요성 ...27
• 라. 학술적 중요성 ...27
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ...30
• 1. 국내 최신 연구동향 (최근 3-5년) ...30
• 가. 버섯의 재배기술 및 효능 연구 ...30
• 나. 버섯연구의 분자생물학적 분석기법 도입 ...30
• 다. 느타리버섯과 그 유전자 연구 ...31
• 라. 버섯 특허의 내용 ...31
• 2. 국외 최신 연구동향 (최근 3-5년) ...31
• 가. 주 연구대상 : 양송이버섯 ...32
• 나. 느타리버섯 연구의 증가 ...32
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ...36
• 제1절 버섯 변이주 개발 및 균주개량에의 이용연구 ...36
• 1. 서론 ...36
• 2. 재료 및 방법 ...36
• 가. U.V mutagenesis에 의한 돌연변이체 제작조건 확립 ...36
• 나. U.V. mutagenesis에 의한 대량의 돌연변이체 분리 및 분석 ...37
• 다. REMI법에 의한 느타리버섯의 형질전환 ...37
• 1) 느타리버섯 (ASI2029)의 uracil 영양요구성 균주를 이용한 형질전환 ...37
• 2) Uracil 요구성 균주의 형질전환체 확인 및 대량의 형질전환체 제작 ...38
• 라. 유전 육종에 유용한 돌연변이체의 선발 ...38
• 마. Carboxin 저항성 유전자를 이용한 느타리버섯의 형질전환 ...38
• 바. 돌연변이 원인유전자의 분리와 구조결정 ...39
• 1) 돌연변이 균주의 프로테옴 분석 ...39
• 가) 버섯의 균사체와 자실체로부터 단백질의 분리 ...39
• 나) 단백질의 정량 및 SDA-PAGE 분석 ...39
• 다) 이차원전기영동 분석 ...40
• 라) Gel 염색 ...40
• 2) 돌연변이 균주의 유전자 발현 분석 ...40
• 가) DD-RT PCR ...40
• 나) Reverse Northern 분석 ...41
• 다) 발현 profile제작 ...41
• 3. 결과 및 고찰 ...46
• 가. UV mutagenesis를 통한 제작한 느타리버섯 변이체의 분석 ...46
• 1) 돌연변이의 선발 ...46
• 2) 자외선 처리 돌연변이 균주의 특성 분석 ...46
• 나. Uracil 영양요구성 균주에 대한 REMI 형질전환 ...49
• 다. 유전 육종에 유용한 돌연변이체의 선발 ...50
• 1) 임성단핵 균주의 선발 ...50
• 2) 흑, 백색 변이주의 선발 ...51
• 라. Carboxin 저항성 유전자를 이용한 느타리버섯의 형질전환 ...52
• 마. 돌연변이 원인유전자의 분리와 구조결정 ...54
• 1) 2D 분석을 통한 색변이체의 변이 원인 검정 ...55
• 가) UV 처리를 통해 분리한 푸른 갓색 버섯과 모균주의 분석 ...55
• 나) 흑백색 변이체의 변이 원인 분석 ...55
• 2) 임성단핵균주의 변이 원인 분석 ...56
• 제2절 느타리버섯의 발생단계별 대량 유전자 분리 및 특이발현 유전자의 분석연구 ...85
• 1. 서론...85
• 2. 재료 및 방법 ...86
• 가. 버섯 자실체의 cDNA library 제작 ...86
• 나. EST 분석 및 기능별 분류 ...86
• 다. Unigene을 이용한 Reverse bloting과 발현 profile 제작 ...87
• 1) Reverse northern blot ...87
• 2) 발현 profile제작 ...87
• 3. 결과 및 고찰 ...88
• 가. 버섯 자실체의 cDNA library 제작 ...88
• 나. cDNA random sequencing에 의한 균사, 자실체, 포자 단계별 발현 유전자 대량 분리 ...88
• 다. EST 염기서열의 기능별 분류 ...88
• 라. 발생 단계별 발현 Profile 분석 ...89
• 마. 전체 느타리버섯의 발생단계의 발현 유전자 대량 분리 ...89
• 바. 느타리버섯 EST의 database 구축 및 website 자료공개 ...90
• 제3절 자실체 형성관련 유전자들의 기능분석 및 육종소재 개발 ...106
• 1. 서론 ...106
• 2. 재료 및 방법 ...106
• 가. 자실체 형성관련 후보유전자의 클로닝 및 발생단계별 발현 특성분석 ...106
• 1) 후보유전자의 선발 및 발현분석 ...106
• 2) 선발 유전자의 full length cDNA 클로닝 ...106
• 3) 선발된 유전자의 정량 RT-PCR을 이용한 발현양상의 분석 ...107
• 나. 형질전환에 의한 자실체 형성관련 유전자들의 기능분석 ...107
• 1) 자실체 형성관련 유전자와 변이체 원인유전자의 재조합 vector 제작 ...107
• 2) 임성단핵 균주에의 재조합 vector의 형질전환 ...107
• 3. 결과 및 고찰 ...109
• 가. 발생단계별 특이발현 유전자의 구조 및 기능유추 ...109
• 1) 느타리버섯에서 유전자의 발현분석을 위한 housekeeping 유전자의 분석 ...109
• 2) 자실체형성과정에서 특이적으로 발현되는 metalloprotease 유전자의 분석 ...109
• 3) 자실체형성과정에서 특이적으로 발현되는 CK-II 유전자의 분석 ...110
• 4) 자실체형성과정에서 특이적으로 발현되는 GPB 유전자의 분석 ...110
• 5) 자실체 형성과정에서 특이 발현하는 유전자의 발현 분석 ...111
• 나. 형질전환에 의한 자실체 형성관련 유전자의 기능분석 ...111
• 1) 자실체 형성관련 유전자와 변이체 원인유전자의 재조합 vector 제작 ...111
• 2) 임성단핵 균주에의 재조합 발현 vector의 형질전환 ...111
• 다. 육종소재 개발 ...112
• 1) 육종소재로서의 흑색변이체 균주 ...112
• 2) 백색, 청색버섯의 이용 ...113
• 3) 소포자 균주의 육종 소재로 이용의 어려움 ...113
• 4) 형질전환체의 이용을 위한 조건 ...113
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ...127
• 1. 연차별 연구개발 내용 ...127
• 2. 연구 개발 목표의 달성도 및 기술발전의 기여도 ...129
• 3. 논문 발표 및 활용 실적 ...132
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ...133
• 1. 추가 연구의 필요성 ...133
• 2. 타 연구에의 응용 ...133
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ...135
• 1. Real time PCR 법에 의한 유전자 발현량의 세밀한 분석 ...135
• 2. RNAi에 의한 유전자 기능분석 ...135
• 3. Carboxin 저항성 형질전환을 통한 manganese peroxidase의 과다발현 ...135
• 4. 느타리버섯의 혈전 용해능 및 metalloprotease 연구 ...136
• 5. 해외 느타리버섯의 연구경향 ...136
• 제7장 참고문헌 ...137