초록 ▼

본 연구는 자연 식물자원들로부터 약리.생리활성 성분을 의약 및 식품용 중간원료의 소재로 실용화하고 이를 주제로 한 기능성 식품을 개발하고자 하였다. 최종 목표달성을 위해서 대표적인 고령화 질환에 따라 제 1, 2, 3 세부과제로 구분하였으며 이를 통하여 수행한 연구 개발 내용 및 범위는 다음과 같다.

(1) 제 1세부과제; 뇌세포 신호전달성분 분해효소를 억제하는 유효성분의 건강기능 식품화

탱자 (Poncirus trifoliata) 에서 acetylcholinesterase (AChE) 억제 활성 성분을

본 연구는 자연 식물자원들로부터 약리.생리활성 성분을 의약 및 식품용 중간원료의 소재로 실용화하고 이를 주제로 한 기능성 식품을 개발하고자 하였다. 최종 목표달성을 위해서 대표적인 고령화 질환에 따라 제 1, 2, 3 세부과제로 구분하였으며 이를 통하여 수행한 연구 개발 내용 및 범위는 다음과 같다.

(1) 제 1세부과제; 뇌세포 신호전달성분 분해효소를 억제하는 유효성분의 건강기능 식품화

탱자 (Poncirus trifoliata) 에서 acetylcholinesterase (AChE) 억제 활성 성분을 추출 정제, 구조 해석 및 소재화를 연구 개발 내용으로 하며 in vitro assay계를 확립하고 ICR-mouse를 이용한 in vivo assay계를 도입하여 인지능력과 독성검사 등을 시행한다. 또한 선정된 시료 및 구조가 밝혀진 활성화 성분 물질의 실용화 및 제품화를 검토하는 것을 연구 범위로 한다.

(2) 제 2세부과제; 뇌신경세포 상해로부터 뇌세포를 보호하는 유효성분의 건강기능 식품화

석류 (Punica granatum L.) 로부터 amyloid β peptide (Aβ)에 의한 뇌신경 독성 저해 미량소재를 추출 정제, 구조해석 및 소재화를 연구개발 내용으로 하며 in vitro assay계를 확립하고 ICR-mouse를 이용한 in vivo assay계를 도입하여 인지능력과 독성 등을 검사하고 저해활성 물질의 실용화를 검토하는 것을 연구 범위로 한다.

(3) 제 3세부과제; 간세포 내의 정보전달 억제를 회복시키는 간암억제 유효성분의 건강기능 식품화

갭 결합을 통한 세포 간 신호전달의 회복 및 matrix metalloproteinase의 활성억제 성분의 검색과 선정하고 in vivo 항암 test를 통한 간암 발생률 억제 효과 검색한다. 간암억제 유효성분을 이용한 건강기능식품의 공업적 실용화 및 제품화를 검토하는 것을 연구 범위로 한다.

Abstract ▼

Alzheimer’s disease (AD) was discovered by Dr. Alois Alzheimer in 1907, and is described as a degenerative disease of the central nervous system with many cognitive and neuropsychiatric manifestations that result in progressive disability and eventual incapacitation. AD is not just among the leading

Alzheimer’s disease (AD) was discovered by Dr. Alois Alzheimer in 1907, and is described as a degenerative disease of the central nervous system with many cognitive and neuropsychiatric manifestations that result in progressive disability and eventual incapacitation. AD is not just among the leading causes of senile dementia, but it is also the most prevalent neurodegenerative disease affecting populations worldwide, and thus is an increasingly threatening international health problem. According to the report from the Alzheimer’s Association, one in eight Americans over the age of 65 and about half of Americans over the age 85 currently suffer from this disease. Moreover, the annual economic cost of AD health care expenses and lost wages for both patients and caregivers are estimated to be approximately 80-100 billion dollars. With the present rate of growth among the elderly population, it is predicted that around 16 million seniors will be affected by 2050. AD patients present with a progressive loss of cholinergic synapses in brain regions associated with higher mental functions, mainly the hippocampus and neocortex. In the AD patients a decrease in acetylcholine (ACh), a neurotransmitter, appears to be a critical element in the development of dementia; this finding has led to research on ways to enhance diminished levels of cholinergic neurotransmitter. Hence, AD and other forms of dementia could be treated by the use of agents that restore the level of acetylcholine through inhibition of both two major forms of cholinesterase: acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BChE). Moreover, the inhibition of AChE plays a key role not only in enhancing cholinergic transmission in the brain, but also in reducing the aggregation of amyloid beta peptide (Ab) and the formation of the neurotoxic fibrils in AD. Thus far, AChE inhibitors approved by the U.S. Food and Drug Administration for the treatment of symptomatic patients with mild to moderate AD are tacrine, donepezil, and rivastigmine.
Despite intensive advancement in research, effective therapeutic options against AD are limited, and have thus increased demand for new drugs. Polyphenolic compounds from fruits and vegetables are currently gaining interest for their beneficial effects, including antioxidative, antiviral, anticancer, and anti-inflammatory effects, as well as the prevention of cardiovascular diseases. However, previous interest in these phytochemicals, with respect to their health-promoting effects, has primarily been focused on examining their roles in protection against cancers and ischemic heart disease. Few studies have investigated their effects on brain functions and neurodegenerative diseases.

목차 Contents

• 제출문 ...1
• 요약문 ...2
• SUMMARY ...6
• CONTENTS ...9
• 목차 ...15
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ...22
• 제 1절 연구개발의 목적 ...22
• 제 2절 연구개발 대상 기술의 경제적?산업적 중요성 ...24
• 1. 기술적 측면 ...24
• 가. 제 1세부과제: 뇌세포 신호전달성분 분해효소를 억제하는 유효성분의 건강기능 식품화 ...24
• 나. 제 2세부과제: 뇌신경 세포 상해로부터 뇌세포를 보호하는 유효성분의 건강기능 식품화 ...24
• 다. 제 3세부과제: 간세포 내의 정보전달 억제를 회복시키는 간암억제 유효성분의 건강기능 식품화 ...25
• 2. 경제·산업적 측면 ...26
• 3. 사회·문화적 측면 ...26
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ...28
• 제 1절 연구개발 대상 기술의 국내?외 현황 ...28
• 1. 해외 기술개발 현황 및 수준 ...28
• 2. 국내 기술개발 현황 및 수준 ...28
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ...31
• 제 1절 뇌세포 신호전달성분 분해효소를 억제하는 유효성분의 건강기능 식품화 ...31
• 1. 서설 ...31
• 2. 재료 ...32
• 3. 실험방법 ...32
• 가. AChE 저해활성 물질 측정을 위한 in vitro assay계 확립 ...32
• (1) 1차 검색용 시료 추출조건과 방법 ...32
• (2) In vitro assay계의 확립 ...32
• 나. AChE 저해활성을 갖는 시료의 검색 및 선정 ...33
• 다. In vitro 세포독성 실험 ...33
• 라. AChE 저해활성 측정을 위한 in vivo assay계 확립, 선정 시료의 활성검사 및 독성검사 ...34
• (1) In vivo assay계 확립 ...34
• (2) 최종 선정된 AChE 억제 시료의 in vivo 독성실험 ...35
• (3) Y-maze ...35
• (4) Passive avoidance test ...36
• 마. 추출법 확립 및 예비정제 ...37
• (1) 추출법 확립 ...37
• (2) 예비정제법의 확립 ...37
• (3) Open column chromatography ...39
• (4) Preparative thin layer chromatography (PLC) ...39
• (5) High performance liquid chromatography (HPLC) ...40
• 바. 정제된 AChE 저해 활성물질 구조분석 ...40
• 사. 선정된 시료로부터 분리한 신경전달물질 분해효소 억제물질의 2차 in vivo test ...40
• (1) In vivo assay계 확립 및 구조가 밝혀진 활성물질의 활성측정 ...40
• (2) Y-maze test ...41
• (3) Passive avoidance test ...41
• (4) 적출된 뇌 조직을 이용한 AChE activity 측정 및 지질과산화도 측정 ...41
• (5) 활성물질의 in vivo상의 독성실험 ...41
• 아. 신경전달물질 분해효소 억제물질의 공업적 실용화 ...42
• (1) 최종적으로 선정된 시료들로부터 추출조건의 최적화 및 공업적 수준의 정제방법 확립 ...42
• (2) 연질 캡슐 제작 ...42
• (3) 드링크제 제작 ...43
• (4) 과립제 제제 ...43
• 자. 제품의 외관 및 안정성 검사 ...43
• 4. 실험결과 ...43
• 가. AChE 저해활성을 갖는 시료의 검색 및 선정 ...43
• 나. In vitro 세포독성 실험 ...47
• 다. AChE 저해활성 측정을 위한 in vivo assay계 확립 과 선정 시료의 활성 및 독성검사 ...48
• (1) 최종 선정된 AChE 억제 활성물질의 in vivo 독성실험 ...48
• (2) Y-maze ...51
• (3) Passive avoidance test ...53
• 라. Poncirus trifoliata 추출물로부터 AChE 저해 활성물질 탐색 ...55
• (1) Solvent partition ...55
• (2) Open column chromatography ...56
• (3) Preparative thin layer chromatography (PLC) ...57
• (4) High performance liquid chromatography (HPLC) ...58
• 마. 정제된 AChE 저해 활성물질 구조분석 ...59
• 바. 선정된 시료로부터 분리한 신경전달물질 분해효소 억제물질의 2차in vivo test ...62
• (1) In vivo assay계 확립 및 methoxsalen의 활성측정 ...62
• (2) Y-maze test ...62
• (3) Passive avoidance test ...64
• (4) 적출된 뇌 조직을 이용한 AChE activity 측정 및 지질과산화도 측정 ...65
• (5) 활성물질의 acute toxicity 측정을 위한 간독성 실험 ...67
• 사. 신경전달물질 분해효소 억제물질의 공업적 실용화 ...69
• (1) 대량 추출 및 대량정제법 확립 ...69
• (2) 추출물의 공업적 식품화 시험 ...71
• (3) 제품의 외관 및 안정성 검사 ...72
• 제 2절 뇌신경세포 상해로부터 뇌세포를 보호하는 유효성분의 건강기능 식품화 ...75
• 1. 서설 ...75
• 2. 재료 및 실험 방법 ...76
• 가. 재료 ...76
• 나. 실험방법 ...77
• (1) In vitro assay계의 확립 및 후보식용식물의 1차 선정 ...77
• (가) 세포배양 ...77
• (나) 1차 검색용 시료 추출조건과 방법 ...77
• (다) DCF-DA assay ...77
• (라) MTT reduction assay ...79
• (마) 선정된 식용식물자원 대량추출 및 시료조제 ...81
• (2) 활성 phytochemicals의 분리 및 정제 ...82
• (가) Solvent partition ...82
• (나) Open column chromatography ...83
• (다) Preparative thin layer chromatography (PLC) ...83
• (라) High performance liquid chromatography (HPLC) ...83
• (3) 정제된 시료로부터 뇌세포를 보호하는 유효성분의 구조분석 ...84
• (가) NMR을 통한 구조 분석 ...84
• (나) Electronic ionization mass (EI-MS)를 통한 분자량 측정...84
• (4) 뇌신경세포 손상 저해활성 측정을 위한 in vivo assay계 확립 과 선정시료의 활성 및 독성검사 ...84
• (가) In vivo assay계 확립 ...84
• (나) Punica granatum extract의in vivo 독성실험 ...84
• (다) Y-maze test ...84
• (라) Passive avoidance test ...85
• 3. 결과 ...85
• 가. In vitro assay계의 확립 및 후보식용식물의 선정 ...85
• (1) 1차 선정 결과 ...85
• (2) 시료 최종 선정 및 세포독성 실험 ...91
• 나. 활성 phytochemicals의 분리 및 정제 ...93
• (1) Solvent partition ...93
• (2) 용매분획별 in vitro assay 결과 ...94
• (가) DCF-DA assay ...94
• (나) MTT reduction assay ...95
• (3) Open column chromatography ...97
• (4) Open column chromatography 분획의 in vitro assay 결과 ...97
• (가) DCF-DA assay ...97
• (나) MTT reduction assay ...99
• (5) PLC ...102
• (가) DCF-DA assay ...102
• (나) MTT reduction assay ...103
• (6) HPLC ...104
• 다. 정제된 시료로부터 뇌세포를 보호하는 유효성분의 구조분석 ...105
• (1) NMR을 통한 구조 분석 ...105
• (2) EI-MS를 통한 분자량 측정 ...107
• 라. In vivo test를 통한 석류 추출물의 효과확인 ...108
• (1) 석류 추출물의 in vivo 독성실험 ...108
• (2) 공간인지능 및 기억학습능력의 1차 in vivo test결과 ...111
• (가) Y-maze test ...111
• (나) Passive avoidance test ...112
• (3) 석류 추출물로부터 분리된 활성물질의 2차 in vivo 독성실험 ...113
• (4) 석류 추출물로부터 분리된 활성물질의 2차 in vivo 행동실험 ...118
• (가) Y-maze test ...118
• (나) Passive avoidance test ...119
• 마. 활성 물질의 공업적 실용화 ...120
• (1) 가공 적성 시험 ...120
• (2) 시작품 제작 ...121
• (가) 연질 캡슐 제작 ...121
• (나) 농축액 및 드링크제제 제작 ...122
• (다) 과립제 제작 ...123
• (3) 제품의 외관 및 안정성 검사 ...124
• 제 3절 간세포 내의 정보전달 억제를 회복시키는 간암억제 유효성분의 건강기능 식품화 ...126
• 1. 서설 ...126
• 2. 재료 및 실험방법 ...127
• 가. 천연소재의 간암억제활성 검색 ...127
• (1) 용매추출에 의한 간암 억제 효능을 갖는 추출물 제조법 확립 ...127
• (2) 항산화 활성 조사법 ...128
• (3) 활성성분 정량 ...128
• (4) In vitro 세포독성 조사 ...128
• (5) 활성검색방법 확립 ...129
• (가) 세포간 정보전달 회복효과 측정 ...129
• (나) FOX assay ...129
• (다) MMP 억제능을 통한 암전이 억제효과 측정 ...129
• 나. 선정된 활성 추출물로부터 유효성분의 확보를 위한 특성 검토 및 추출물 전 처리 조건 확립 ...130
• (1) 유근피의 항암 및 항암전이 효과 ...130
• (가) 천연물 추출 조건 ...130
• (나) MTT assay ...130
• (2) 암전이 억제효과 검색 ...131
• (가) Gelatin zymography ...131
• (3) 세포간 갭결합 신호전달 회복효과 검색 ...131
• (4) 활성물질의 생물학적유용성 및 혈관 신생성 억제효과 검토 ...131
• (가) Caco-2 human intestinal model ...132
• (나) Chorioallantoic membrane (CAM) assay ...132
• (5) 항산화 효과 입증 및 부분정제 유효성분 함량 분석 ...133
• (가) 항산화 효과 검토 (DPPH assay) ...133
• (나) 활성성분 분석 ...133
• (6) 추출물의 활성 물질의 규명 ...133
• (가) MTT assay를 이용한 용매별 분획의 활성 입증 ...133
• (나) 용매 Fraction의 Molecular Weight에 의한 분획물질의 활성 입증 ...134
• (다) HPLC를 통한 최종 활성 분획 물질의 분리 ...134
• (7) 알코올에 의한 간 손상에 대한 보호 능력 입증 ...134
• (가) 알코올 분해효소인 alcohol dehydrogenase와 aldehyde dehydrogenase의 활성 측정 ...134
• (나) 동물실험을 통한 간 보호 능력 측정 ...134
• 다. 추출물의 간암 활성 입증 ...135
• (1) CAA (Cellular Antioxidant Activity) assay를 통한 유근피 추출물의 활성 측정 ...135
• (2) Annexin V-PI staining을 통한 apoptosis 유도 현상 관찰 ...136
• (3) ELISA법을 이용한 간암전이 지표 효소인 MMP-2와 MMP-9 정량 ...136
• 라. 파래의 항암 효과 ...136
• (1) MTT assay ...136
• (2) 파래의 항혈전 효과 ...136
• (가) 추출 용매에 따른 항응고 활성 검토 ...137
• (나) 알칼리 추출 농도에 따른 항응고 활성 검토 ...137
• (다) Activated partial thromboplastin time (APTT)에 의한 항응고 활성측정 ...137
• 마. 유근피 추출물로부터 간암억제 유효성분의 공업적 실용화 ...137
• (1) 유근피 추출물을 이용한 연질 캡슐 제작 ...137
• (2) 유근피 추출물을 이용한 드링크제 제작 ...138
• (3) 유근피 추출물을 이용한 과립제 제제 ...138
• 바. 제품의 외관 및 안정성 검사 ...138
• 3. 결과 ...138
• 가. 용매추출에 의한 간암 억제 효능을 갖는 추출물 최적조건 확립 ...138
• 나. 복합물질에 대한 항산화 활성 비교법 확립 ...139
• 다. In vitro 세포독성 조사 ...141
• 라. 활성검색방법 확립 ...142
• (1) 세포간 정보전달 회복효과 측정 ...142
• (2) 암전이 억제효과 측정 ...144
• 마. 선정된 활성 추출물로부터 유효성분의 확보를 위한 특성 검토 및 추출물 전 처리 조건 확립 ...144
• (1) 간암세포 증식 억제효과 ...145
• (2) 암전이 억제효과 검색 ...146
• (3) 세포간 갭결합 신호전달 회복효과 검색 ...147
• (4) 항산화 효과 입증 및 부분정제 유효성분 함량 분석 ...149
• (5) 부분정제 획분의 활성유지 확인 ...150
• 바. 알코올에 의한 간 손상에 대한 보호 능력 입증 ...151
• (1) 알코올 분해효소인 alcohol dehydrogenase와 aldehyde dehydrogenase의 활성 측정 ...151
• (2) 동물실험을 통한 간 보호 능력 측정 ...152
• (가) In vivo assay계 확립 및 유근피 추출물의 활성 측정 ...152
• (나) 혈청분석에따른aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), serum triglyceride(STG), total cholesterol, low density lipoprotein (LDL) cholesterol, high density lipoprotein (HDL) cholesterol의활성측정 ...152
• (다) 조직 분석에 따른 hepatic triglyceride (STG), total cholesterol, low density lipoprotein (LDL) cholesterol, high density lipoprotein (HDL) cholesterol의 활성 측정 ...155
• (라) 조직 절편 분석을 통한 세포 손상도 측정 및 triglyceride 측정 ...156
• 사. 추출물의 간암 활성 입증 ...158
• (1) CAA(Cellular Antioxidant Activity) assay를 통한 유근피 추출물의 활성 측정 ...158
• (2) Annexin V-PI staining을 통한 Apoptosis 유도 현상 관찰 ...159
• (3) ELISA법을 이용한 간암전이 지표 효소인 MMP-2와 MMP-9 정량 ...160
• 아. 추출물의 활성 물질의 규명 ...160
• (1) MTT assay를 이용한 용매별 분획의 활성 입증 ...160
• (2) 용매 fraction의 molecular weight에 의한 분획물질의 활성 입증 ...161
• (3) HPLC를 통한 최종 활성 분획 물질의 분리 ...162
• 자. 파래의 항암, 항혈전 효과 ...163
• (1) 파래 추출물의 HepG2의 생존율에 미치는 영향 ...163
• (2) 파래 추출물의 B16/F10의 생존율에 미치는 영향 ...164
• (3) 파래 추출물의 HT1080의 생존율에 미치는 영향 ...165
• (4) 파래 추출물의 MCF7의 생존율에 미치는 영향 ...166
• (5) 파래의 항혈전 효과 ...167
• (가) 추출 용매에 따른 항응고 활성 검토 ...167
• (나) 농도에 따른 항응고 활성의 검토 ...169
• 차. 유근피 추출물로부터 간암억제 유효성분의 공업적 실용화 ...170
• (1) 유근피 추출물을 이용한 연질 캡슐 제작 ...170
• (2) 유근피 추출물을 이용한 드링크제 및 농축액 제작 ...171
• (3) 유근피 추출물을 이용한 과립제 및 캡슐 제제 ...172
• 카. 제품의 외관 및 안정성 검사 ...172
• 제 4장 목표 달성도 및 관련분야에의 기여도 ...175
• 제 1절 연구 개발 목표의 달성도 ...175
• 1. 연차별 연구 개발 목표 달성도 ...175
• (1) 1차년도 연구 개발 목표 달성도 ...175
• (2) 2차년도 연구 개발 목표 달성도 ...176
• (3) 3차년도 연구 개발 목표 달성도 ...177
• 2. 평가 착안점 ...178
• 제 2절 관련 분야에의 기여도 ...179
• 1. 학문.기술적 측면 ...179
• 2. 경제.산업적 측면 ...179
• 제 5장 연구개발결과의 활용계획 ...180
• 제 1절 추가연구의 필요성 ...180
• 제 2절 타 연구에의 응용 ...180
• 제 3절 기업화 추진방안 ...180
• 제 6장 연구개발 과정에서 수집한 해외과학기술정보 ...182
• 1. Measurement of oxidative stress (DCF-DA method) ...182
• 2. Assessment of cell viability (MTT reduction assay) ...182
• 3. Assessment of AChE activity (Ellman...182
• 4. Evaluation of learning and memory capacity using in vivo model ...183
• 가. Y-maze test ...183
• 나. Passive avoidance test ...183
• 제 7장 참고문헌 ...184
• 부 록 ...187