1. 연구개발사업의 목적 : 새로운 난소암 면역치료제를 위한 mCb-1의 향체 개발 2. 연구방법: 1) mCb-1의 암 특이 단백질 타당정 연구 ▷ 난소암 환자 조직에서 Real-time PCR, Immunohistochemistry, Western blot 등을 통해 mCb-1 유전자 및 단백질 발현 조사 ▷ 난소암 세포주 및 다른 암 세포주에서 mCb-1의 발현 조사 ▷ mCb-1의 세포 내 위치 조사 2) mCb-1의 세포 및 분자생물학적 기능 연구 ▷ mCb-1 유전자 클로닝 및 mCb
1. 연구개발사업의 목적 : 새로운 난소암 면역치료제를 위한 mCb-1의 향체 개발 2. 연구방법: 1) mCb-1의 암 특이 단백질 타당정 연구 ▷ 난소암 환자 조직에서 Real-time PCR, Immunohistochemistry, Western blot 등을 통해 mCb-1 유전자 및 단백질 발현 조사 ▷ 난소암 세포주 및 다른 암 세포주에서 mCb-1의 발현 조사 ▷ mCb-1의 세포 내 위치 조사 2) mCb-1의 세포 및 분자생물학적 기능 연구 ▷ mCb-1 유전자 클로닝 및 mCb-1를 과발현하는 stable cell line 제작 ▷ mCb-1을 과발현하는 stable cells의 세포성장 조사 ▷ mCb-1 siRNA를 이용한 mCb-1 gene knockdown을 통한 기능 연구 ▷ 세포사멸을 일으키는 것으로 알려진 mCb-1의 mouse 항체를 이용하여 cell proliferation, invasion, 그리고 migration에 대한 mCb-1의 기능 연구 ▷ mCb-1을 이용한 인간항체의 치료 효능을 예측하기위해 먼저, in vitro 실험에서 mCb-1의 cell viability, invasion, 그리고 migration 기능을 저해하는 mouse mCb-1을 이용하여 동물실험 수행 ▷ mCb-1의 기능을 세포, 분자생물학적으로 이해하기 위해 mCb-1 stable cell line의 global gene expression을 cDNA microarray 분석을 통한 mCb-1과 관련된 신호전달체계 연구 ▷ cDNA microarray 결과로부터 유추한 mCb-1관련 신호전달체계에 대해 분자, 세포생물학적인 실험을 통해 검증 3) mCb-1 인간항체 개발 및 효능 연구 ▷ mCb-1인간항체 제작은 한국생명공학연구원의 박 영우박사팀과의 공동연구로 진행 ▷ mCb-1의 기능적으로 중요한 영역을 Fc와 fusion한 항원 클로닝 및 정제 ▷ 인간항체 라이브러리 스크리닝을 통한 mCb-1 인간항체 확보 ▷ 확보된 mCb-1 인간항체의 mCb-1 binding assay ▷ in vitro & in vivo에서의 효능연구 ▷ mCb-1 인간항체의 epitope mapping 3. 연구결과 1) mCb-1의 암 특이 단백질 타당성 연구 ▷ 난소암 조직 마이크로어레이 결과에서 mCb-1 유전자 발현이 난소암, 특히 borderline tumor 와 serous type 난소암에서 4-13배 정도 증가 ▷ 난소암 세포주에서도 mCb-1의 유전자 및 단백질 발현이 증가 ▷ 난소암 조직 및 세포주에서 mCb-1이 세포막에 위치하고 있음올 Immunohistochemistry와 immunofluorescence microscopy를 통해 확인 2) mCb-1의 세포 및 분자생물학적 기능연구 ▷ mCb-1을 과발현하는 stable cell line이 벡터 stable cell line에 비해 세포성장 증가 ▷ siRNA에 의한 mCb-1의 knockdown은 세포성장, invasion, migration올 저해하였음 ▷ mCb-1의 항체도 세포성장, invasion, migration올 저해하였옴 ▷ mCb-1 mouse 항체는 난소암 모델 동물에서 암의 성장올 억제하였음 ▷ mCb-1과 관련된 신호전달체계의 연구를 통해 mCb-1이 과발현된 세포주에서 NF-kB 관련 유전자들의 발현 증가함올 밝힘 ▷ NF-kB-responsive reporter gene assay, subcellular fractionation, immunofluoresence microscopy 실험수행 결파 mCb-1 과발현 세포주에서 NF-kB 신호전달체계가 활성화되어 있음을 확인 ▷ NF-kB signaling의 downstream signal도, 증가되었옴올 TNF-α 및 IL-6 유전자 발현 양사으 그리고 IL-6의 ELISA실험에서 확인함 3) mCb-1 인간항체 생산 ▷ mCb-1 의 extracellular region II를 인지하는 인간항체 (10E4)를 확보하여 binding assay를 한 결과 mouse 항체보다 10E4가 더 강하게 binding함을 확인 4) mCb-1 인간항체의 in vitro 및 in vivo 기능연구 ▷ 1OE4를 2774 난소암 세포주에 처리하였을 때 세포성장, invasion, migration을 억제하였음 ▷ 동물을 이용한 in vivo 실험에서 10E4를 주사한 mouse의 tumor volume이 대조군인 IgG를 주사한 mouse에 비해 60% 가량 줄어들었고 tumor weight도 약 60% 가량 줄었음 ▷ Metastasis 모델 mouse의 복강에 10E4를 주사한 결과 IgG 항체를 주사한 mouse에 비해 생존율이 증가하였음 ▷ 따라서 10E4가 암 성장을 억제하고 생존율을 중가함을 확인하였음 4. 기대효과 ▷ 세계 최초의 난소암 특이 항체치료제 개발 ▷ 암 특이 항원을 이용한 항체치료제 개발 가능성 제시 ▷ mCb-1을 타켓하는 암 진단 및 in vivo imaging 물질 개발
Abstract▼
1. Purpose: Development of Anti-mCb-1 Therapeutic Antibody for Ovarian Cancer 2. Methods: 1) Study of mCb-1 as a cancer-specific protein ▷ Analysis of mCb-1 mRNA and protein expression levels in ovarian cancer patient's tissues by real-time PCR, immunohistochemistry, and western blot analys
1. Purpose: Development of Anti-mCb-1 Therapeutic Antibody for Ovarian Cancer 2. Methods: 1) Study of mCb-1 as a cancer-specific protein ▷ Analysis of mCb-1 mRNA and protein expression levels in ovarian cancer patient's tissues by real-time PCR, immunohistochemistry, and western blot analyses ▷ Analysis of mCb-1 mRNA and protein expression levels in ovarian and other cancer cell lines ▷ Study of mCb-1 subcellular localization 2) Functional study of mCb-1 ▷ Cloning of mCb-1 and establish cell line stable expressing mCb-1 ▷ Cell proliferation assay of mCb-1 stable cell line ▷ Functional study of mCb-1 by siRNA knockdown ▷ Functional study of mCb-1 on cell proliferation, invasion, and migration using neutralized anti-mCb-1 mouse antibody ▷ Animal study of neutralized anti-mCb-1 mouse antibody as a preliminary experiment for human mCb-1 antibody ▷ Identification of mCb-1-related signal pathway by analysis of global gene expression profile in mCb-1 stable cells ▷ Confirm mCb-I-related signal pathway by cellular and molecular biological methods 3) Preparation of mCb-1 human antibody and the efficacy study ▷ Preparation of human antibody by collaborating with Dr. YW Park, KRIBB, Daejeon ▷ Cloning of Fe-fused functional domain of mCb-1 and purification to obtain mCb-1 antigen ▷ Human antibody library screening for mCb-1 ▷ Binding assay of mCb-1 human antibody ▷ Efficacy study of mCb-1 human antibody in an in vitro & in vivo ▷ Epitope mapping of mCb-1 human antibody 3. Results 1) Study of mCb-1 as a cancer-specific protein ▷ Overexpression of mCb-1 by 4-13 folds in ovarian cancer tissues, especially bordeline tumor and serous type ovarian cancer ▷ Overexpression of mCb-1 in ovarian cancer cell lines ▷ Cell surface localization of mCb-1 on ovarian cancer tissues and cell lines detected by immunohistochemistry and immunofluorescence microscopy 2) Functional study of mCb-1 ▷ Induction of cell viability by overexpression of mCb-1 in mCb-1 stable cell line compared with vector stable cell line ▷ Inhibition of cell proliferation, invasion, and migration by mCb-1-specific siRNA ▷ Inhibition of cell proliferation, invasion, and migration by neutralized anti-mCb-1 mouse antibody ▷ Inhibition of cancer growth by neutralized anti-mCb-1 mouse antibody in ovarian cancer cell-xenograft mouse ▷ Induction of NF-kB-related genes by overexpression of mCb-1 ▷ Activation of NF-kB signal pathway in mCb-1 stable cell line detected by NF-kB-responsive reporter gene assay, subcellular fracitonation, and immunofluorescence microscopy ▷ Up-regulation of NF-kB downstream signals detected by TNF-a and IL-6 gene expression levels and ELISA 3) Preparation of mCb-1 human antibody and the efficacy study ▷ Strong binding of mCb-1 human antibody (10E4) on 2774 cells 4) Efficacy study of mCb-1 human antibody in an in vitro & in vivo ▷ Inhibition of cell proliferation, invasion, and migration of 2774 ovarian cancer cell line by 10E4 ▷ Reduced tumor volume and weight by 60% in 10E4-injected ovarian cancer-xenograft mouse ▷ Prolonged survival of 10E4-injected metastasis model mouse compared with human IgG-injected mouse ▷ Confirmed the efficacy of mCb-1 human antibody on inhibition of tumor growth and prolonged survival 4. Expected Contributions ▷ Development of ovarian cancer-specific therapeutic antibody ▷ Development of therapeutic antibody targeting cancer-specific antigen ▷ Development of cancer-specific diagnostic and imaging agents targeting mCb-1
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