초록 ▼

$\bullet$ 본 연구의 목표는 국제적으로 인증된 안점막자극시험(소각막활용, OECD437), 피부자극시험(인공피부모델 활용시험) 및 피부감작성시험(비방사선국소림프절시험법, LLNA:BrdU-ELISA 시험법, OECD TG442B)을 국내에 도입하여 시험법의 최적조건을 확립하고 실험실간의 검증 연구를 통해 국내에서 활용할 수 있는 기반을 마련한다. 이에 따라 대체시험법에 대한 국가 위상을 제고하여 국제 공동연구 추진에 경쟁력을 확보하는 것이다.
$\bullet$ 비방사선국소림프절시험

$\bullet$ 본 연구의 목표는 국제적으로 인증된 안점막자극시험(소각막활용, OECD437), 피부자극시험(인공피부모델 활용시험) 및 피부감작성시험(비방사선국소림프절시험법, LLNA:BrdU-ELISA 시험법, OECD TG442B)을 국내에 도입하여 시험법의 최적조건을 확립하고 실험실간의 검증 연구를 통해 국내에서 활용할 수 있는 기반을 마련한다. 이에 따라 대체시험법에 대한 국가 위상을 제고하여 국제 공동연구 추진에 경쟁력을 확보하는 것이다.
$\bullet$ 비방사선국소림프절시험법(LLNA법)은 OECD 가이드라인으로 등재된 BrdU ELISA 측정법과 BrdU Flow cytometry 측정법을 활용한 방법을 확립하여 본 시험법에 대한 재현성 및 validity를 확인하였다. 이를 통하여 OECD 가이드라인으로 기재된 국소림프절시험법을 확립하여 국내 적용 가능성을 확보하였다.
$\bullet$ 인간의 피부각질세포로 재구성되어 인간의 피부와 유사한 구조를 갖는 인공피부모델인 $KeraSkin^{TM}$-VM을 이용한 피부자극시험의 정확성, 재현성 및 반복성을 높이기 위한 인공피부모델의 quality control(QC) 시험항목과 기준은 ①세포생존율 $0.7{\leq}OD_{NC}{\leq}1.5$, ②피부방어막기능 $4hr{\leq}ET-50_{Triton\;X-100}{\leq}9hr$, ③조직병리 두께 $50{\mu}m$이상의 각질층을 가진 분화된 표피로 설정하였다.
$\bullet$ 조건 확인시험을 통해 시험물질 적용양은 $30{\mu}l$, 적용시간은 45분, 후배양시간은 42시간, 세척횟수 및 방법은 4회를 실시하는 것으로 확정하고, 본 시험조건에 대해 표준작업지침서(SOP)를 작성하였으며, 실험실간 검증을 위해 protocol transfer를 실시한 후, 실험실내, 실험실간 재현성을 OECD 가이드라인(TG439)에 의해 validation을 실시하였다. 실험실내 검증결과, (주)아모레퍼시픽의 실험실내 재현성은 95%로 나타나 OECD 가이드라인에서 요구하는 90%를 상회하였으며, 경희대학교와 계명대학교의 경우 실험실내 재현성이 85%로 OECD 기준에 미치지는 못했으나 근접하였다. 실험실간 검증결과에서는 (주)아모레퍼시픽, 계명대학교 및 경희대학교의 실험실간 재현성이 80%로 확인되어 OECD 가이드라인에서 요구하는 기준인 80%에 부합하였다.
$\bullet$ 국제적으로 널리 통용되는 안점막 자극시험 대체시험법인 Bovine corneal opacity and permeability(BCOP) assay는 2009년 9월 OECD guideline 437에 등재되었다. 그러나, 이 시험법이 실제 활용되기 위해서는 보다 광범위하고 지속적인 validation study가 수행되어야 하며 기존에 확립된 방법을 바탕으로 보완 및 데이터 자료 축적을 통하여 국제 조화를 위한 국내 자료 확보가 시급하다. 본 과제에서는 OECD guideline 437에서 제시한 10개 물질 중 2006년-2008년에 국내에서 시행하지 않은 물질을 선정하여 in vitro 안점막 자극시험을 수행하고 ICCVAM에서 제시하는 false positive, false negative 물질 중 4가지를 적용하여 평가하였다.
$\bullet$ 본 과제에서 확립된 동물대체시험법들은 워크숍을 개최하여 관련 기관 (CRO기관과 화장품회사, 대학교)과 종사자들에게 실험과 교육을 실시함으로써 국내에 보급되고 있다.

Abstract ▼

$\bullet$ According to the animal protection and animal ethics in Europe, the concept of 3R(replacement, reduction, refinement) were conducted and in vitro alternatives were vigorously developed in the world. Since animal ethics was applied to the development of cosmetic products through

$\bullet$ According to the animal protection and animal ethics in Europe, the concept of 3R(replacement, reduction, refinement) were conducted and in vitro alternatives were vigorously developed in the world. Since animal ethics was applied to the development of cosmetic products through the enforcement of $7^{th}$ Amendment to the Cosmetics Directive and to chemical registration through REACH regulation, the development of alternatives has been a hot issue to the toxicologist.
$\bullet$ Thus, the present researches were conducted to develop in vitro alternatives, especially skin-irritation(Kereskin), skin sensitization(LLNA), & eye-irritation(BCOP assay). Test conditions were properly optimized and validated within laboratory and between laboratories. Through holding open workshop, the test methods were transferred to many domestic scientists.
$\bullet$ Murine local lymph node assay (LLNA, OECD 429) using radioactive compound have been used in the world as an animal alternative test. Non-radio active method was developed using Flow cytometry (FC), immunohistochemistry and ELISA measurement. In the present study, flow cytometry and ELISA measurement for LLNA assay in chemicals was performed and validated between laboratories. Repeatability and correlation between two laboratories were well established.
$\bullet$ The reproducibility of the quality control value on $KeraSkin^{TM}$-VM model has been evaluated on 20 batchs, with an acceptance limit for ① $0.7{\leq}OD_{NC}{\leq}1.5$, ②TEX>$4hr{\leq}ET-50_{Triton\;X-100}{\leq}9hr$, ③ differentiated epidermis with stratum corneum, thickness over $50{\mu}m$.
An optimized test method of $KeraSkin^{TM}$-VM based on a 45min application with nylon mesh followed by a 42hr post-incubation period was established. $KeraSkin^{TM}$-VM model showed 95% within-laboratory reproducibility with sensitivity of 90% and a specificity of 70% (Lead lab: Amorepacific). This result suggest that $KeraSkin^{TM}$-VM is applicable to the skin irritation test.
$\bullet$ Bovine corneal opacity and permeability (BCOP) assay was performed in the 10 compounds offered by OECD guideline 437. And 4 compounds including false positive, or false negative compound offered by ICCVAM was analysed by BCOP assay.

목차 Contents

• 표지...1
• 용역연구개발과제 최종보고서...4
• 제출문...5
• 목차...6
• I. 총괄연구개발과제 요약문...9
• 1. 국문요약문...9
• 2. 영문요약문...11
• II. 총괄연구개발과제 연구결과...13
• 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성...13
• 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법...23
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰...42
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과...90
• 제5장 총괄주요연구 변경사항...94
• 제6장 총괄참고문헌...94
• 제7장 총괄첨부서류...95
• III. 제 1세부연구개발과제 연구결과:ELISA 측정법 활용한 비방사선국소림프절시험법(LLNA)의 확립 및 실험실간 검증연구...101
• 제1장 세부연구개발과제의 요약문...102
• 제2장 세부연구개발과제의 목적...104
• 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법...109
• 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰...116
• 제5장 세부참고문헌...146
• IV. 제 2세부연구개발과제 연구결과:인공피부모델을 이용한 피부자극시험법 확립...148
• 제1장 세부연구개발과제의 요약문...149
• 제2장 세부연구개발과제의 목적...152
• 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법...156
• 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰...162
• 제5장 세부참고문헌...193
• V. 제 3세부연구개발과제 연구결과:안점막 자극 대체시험...196
• 제1장 세부연구개발과제의 요약문...197
• 제2장 세부연구개발과제의 목적...198
• 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법...202
• 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰...208
• 제5장 세부참고문헌...233
• 제8장 첨부서류...235