초록 ▼

바이오의약품의 투자규모 증대에 따라 첨단제제로 분류되었던 유전자치료제, 세포치료제의 제품화가 가시화 되고 있다. 이들의 제품화 촉진과 안전한 사용을 위해서는 평가기관의 경험축적 및 가이드라인 마련이 필수요건이라 할 수 있다. 본 과제에서는 첨단제제중 배아줄기세포와 유전자치료제의 안전성과 유효성 평가 시험을 수행하였다. 첫 번째 부분에서는 배아줄기세포의 종양형성능 지표를 개발하고자 하였다. 배아줄기세포는 무한증식능과 전분화능을 가지고 있어, 재생의학에 활용 가능성이 매우 높지만 생체주입시 종양형성 위험이 잔존하여 이에 대한 안전성 평

바이오의약품의 투자규모 증대에 따라 첨단제제로 분류되었던 유전자치료제, 세포치료제의 제품화가 가시화 되고 있다. 이들의 제품화 촉진과 안전한 사용을 위해서는 평가기관의 경험축적 및 가이드라인 마련이 필수요건이라 할 수 있다. 본 과제에서는 첨단제제중 배아줄기세포와 유전자치료제의 안전성과 유효성 평가 시험을 수행하였다. 첫 번째 부분에서는 배아줄기세포의 종양형성능 지표를 개발하고자 하였다. 배아줄기세포는 무한증식능과 전분화능을 가지고 있어, 재생의학에 활용 가능성이 매우 높지만 생체주입시 종양형성 위험이 잔존하여 이에 대한 안전성 평가지표 개발이 시급하다. 본 연구에서는 종양형성 관련 가능성이 높은 지표에 대한 세포분리 및 in vivo 종양형성능 시험을 통해 사람배아줄기세포의 종양형성 예측평가 지표를 제시하고자 하였다. 5-step method를 이용하여 사람배아줄기세포를 신경세포로 분화유도한 후 특성평가를 통해 stage3를 세포분리 단계로 결정하고, 미분화지표(SSEA3) 및 신경전구세포 지표(CD133)에 대한 세포분리를 수행하였다. 각 분획세포에 대한 in vivo 종양형성능 시험 결과, CD133 양성 및 음성분획세포 투여군은 종양형성에 별다른 영향을 주지 않았으며, SSEA3 양성분획세포 투여군은 10주부터 종양이 형성되어 12주에 모두 종양형성이 관찰되었다. 그러나 SSEA3 음성분획세포 투여군은 시험기간동안 종양형성이 관찰되지 않아 미분화지표 발현 세포의 제거가 배아줄기세포의 종양형성에 영향을 미치는 것으로 평가되어 SSEA3를 배아줄기세포의 종양형성 예측 평가지표로 제시하였다. 이를 통해 임상적용 가능성이 높아지고 있는 배아줄기세포치료제의 안전성 평가시 참고할 수 있는 예측지표로 활용할 수 있을 것으로 판단된다. 두 번째 부분인 유전자치료제의 경우 HBsAg, luciferase를 발현하는 DNA 플라스미드를 2009년에 구축하여 EP를 병용한 안전성과 유효성 평가시 고려사항이 될 수 있는 독성시험과 개선된 유전자전달에 의한 플라스미드의 조직별 분포 및 단백질 발현 지속성과 면역세포활성을 평가하였다. 독성시험의 경우, 안전성평가 연구소(GLP기관)에서 EP 병용투여 시 마우스에서의 용량별 단회독성과 심장독성 평가를, 원숭이에서는 2주간격으로 5회 반복투여에 따른 반복투여독성과 심장기능 평가를 수행하였고, 시험결과 EP 도입 및 플라스미드 투여에 따른 독성은 나타나지 않았다. 유전자치료제 잔류 및 벡터의 생체분포 시험자료는 중요한 약리자료일 뿐 아니라 독성시험에 있어서도 의미 있게 평가되어 왔다. 2009년 마우스에서의 벡터의 분포, 발현지속 및 삽입에 관한 평가시험에 이어 원숭이에서의 DNA의 생체분포를 분석하였다. EP 병용투여에 의한 개선된 플라스미드 전달 효과가 DNA 및 단백질의 체내동태 및 잔류량에 미치는 영향을 평가하기 위해 Balb/c 마우스 및 원숭이에 투여방법 및 용량을 변화시켜 투여하였다. 실험결과 Balb/c 마우스를 이용한 실험에서는 DNA 백신을 투여한 뒤 1일보다 2일째 발현된 단백질 양이 많았으며 2일 째 투여 근육부위 및 비장을 제외하고는 단백질이 분포하지 않았다. 단백질 발현은 투여 10일까지 지속되었으나 2일에 비해 많이 분해된 상태였다. 원숭이에서는 투여근육에서 ELISA를 이용한 방법에서만 검출되었으며 western blot 시험에서는 검출되지 않았다. 정량 PCR법을 사용한 유전자치료제 벡터의 생체분포 분석결과, 원숭이와 마우스 모두에서 플라스미드 제제는 근육 투여 후 빠른 시간 내에 정량한계 이하로(100개/$1{\mu}g$ 게놈 DNA) 소실되었고 투여부위를 제외하고는 주요장기에 분포하지 않았다. 또한 유전자치료제 생체분포 분석법 가이드라인 전문가 협의체를 구성하여 2회의 회의 및 워크샵을 통해 가이드라인을 마련하였다. 위의 실험결과를 바탕으로 줄기세포치료제의 종양 원성과 EP를 병용 투여하는 DNA 백신 제제의 안전성 평가를 위한 시험법 및 평가 기준을 제시할 수 있었다.

Abstract ▼

Recent years have witnessed significant innovation in the biopharmaceuticals area. The reason for this is that biopharmaceuticals can be tailored for a specific problem in a given individual. The greatest potential of pharmaceutical biotechnology lies in gene therapy and cell therapy. Embryonic stem

Recent years have witnessed significant innovation in the biopharmaceuticals area. The reason for this is that biopharmaceuticals can be tailored for a specific problem in a given individual. The greatest potential of pharmaceutical biotechnology lies in gene therapy and cell therapy. Embryonic stem cells (ESCs) give rise to the possibility that stem cell therapy. However, before cell replacement therapies can be used, the problems with the tumorigenicity of ESCs must be solved. In the present study, we attempt to find biomarkers related with tumor formation of ESCs. We induced neuronal differentiation from H9, a hESCs, using a five-stage method and performed characterization of hESCs in each developing stages. We decided stage 3 as the step of cell sorting and performed separating cells on SSEA3 and CD133 using the MACS. In the results of in vivo assay with each sorted cells, CD133 positive and negative cells were not related with tumorigenesis. But groups injected the SSEA3 positive cells showed high levels of tumor forming rate as 100%, otherwise the group injected SSEA3 negative cells not detected tumorigenesis during periods of study. In these results, we recognized that SSEA3 related with undifferentiated status has important roll in reduction of tumor formation on hESCs tumorigenesis, suggesting that these appears to be a useful biomarker for the assessment of the safety of stem cell-based therapies using hESC. At part two, gene therapy product study, in order to provide a strong scientific base for regulatory review of gene therapy, Korea Institute of Toxicology(approved GLP) conducted acute, repeated and heart related toxicity (ECG)test in animals(rat and monkey). There were no DNA vaccine injection toxicity affected by EP combination. Protein persistence and plasmid biodistribution study data of gene therapy products have been evaluated not only as the important pharmacological data but also meaningfully in the toxicity study. For biodistribution, persistence and integration studies, we performed with the real time-PCR(Q-PCR) method to detect and quantify the amount of vector DNA in vivo assay in these days, which is more sensitive and convenient. To evaluate advanced DNA vaccine delivery by EP, we tested protein persistence and biodistribution study in not only mouse but also moneky. Taken together, we established the methodsand biomarker with standing for tumorigenicity and standard protocols to evaluate pharmacokinetics and efficacy of gene therapy products using electroporator.

목차 Contents

• 표지...1
• 자체연구개발과제 최종보고서...2
• 요약문...3
• Summary...4
• 목차...5
• I. 연구개발과제 연구결과...6
• 제1장 연구개발과제의 개요...6
• 제2장 연구개발과제의 국내ㆍ외 연구개발 현황...13
• 제3장 연구개발과제의 연구수행 내용 및 결과...20
• 제4장 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...57
• 제5장 연구개발과제의 목표달성도 및 관련분야에의 기여도...61
• 제6장 연구개발과제 연구개발 결과 활용계획...63
• 제7장 참고문헌...65
• 제8장 첨부서류...73
• 별첨 1. 정량 PCR을 이용한 유전자치료제 생체분포 시험방법 밸리데이션 시 고려사항...73
• 별첨 2. ○ 줄기세포의 면역형광염색법 SOP...99