초록 ▼

1. 최종목표
Tritirachium album으로부터 Proteinase K 유전자를 크로닝하고, 이를 과잉 발현하는 재조합 대장균을 개발함.
2. 개발내용 및 결과
○ Proteinase K의 생산균인 Tritirachium album를 확보하고 배양배지별 성장정도를 조사한 후 성장이 우수한 배지에서 진탕배양하여 Proteinase K 유전자 크로닝에 사용할 총 염색체 DNA를 분리할 균체를 얻었다.
○ Tritirachium album 균체로부터 총 염색체 DNA를 분리하고 전기영동과 분광광도계를 활용하여

1. 최종목표
Tritirachium album으로부터 Proteinase K 유전자를 크로닝하고, 이를 과잉 발현하는 재조합 대장균을 개발함.
2. 개발내용 및 결과
○ Proteinase K의 생산균인 Tritirachium album를 확보하고 배양배지별 성장정도를 조사한 후 성장이 우수한 배지에서 진탕배양하여 Proteinase K 유전자 크로닝에 사용할 총 염색체 DNA를 분리할 균체를 얻었다.
○ Tritirachium album 균체로부터 총 염색체 DNA를 분리하고 전기영동과 분광광도계를 활용하여 그 크기와 양을 측정한 결과 Proteinase K를 크로닝하기에 적합한 상태임을 확인하였다.
○ Proteinase K의 유전자 정보를 활용하여 이를 크로닝하는데 사용할 Primers를 4 종 고안하고 합성하였다. 이를 이용하여Tritirachium album 게놈 DNA를 대상으로 PCR을 수행하여 최종적으로 intron이 없는 Proteinase K 구조유전자를 얻었다.
○ Proteinase K를 재조합 대장균에서 생산하기 위해 전구체 형태로 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드와 mature form으로 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드를 제조하였다. 또한 발현량을 극대화하기 위해 강력한 promoter인 T7 promoter를 지닌 pET21a(+)에 Proteinase K 유전자를 도입하여 재조합 플라스미드를 제조하였다.
○ Escherichia coli BL21(DE3)에 Proteinase K 과잉발현용 재조합 플라스미드를 형질전환하여 재조합 대장균을 제조하였다.
○ Proteinase K 전구체 형태로 발현되는 재조합 대장균에서는 skim milk의 분해환이 약하게 관찰됨으로써 재조합 대장균에서 Proteinase K가 생산됨을 확인하였다.
○ Mature form의 Proteinase K 유전자를 재조합 대장균에서 발현시키기 위해서 액상 배양하면서IPTG를 처리하고 여러온도에서 배양한 후 배양균체를 파쇄하여 SDS-PAGE로 균체단백질을 분석한 결과 Proteinase K가 과량 생산되었음을 확인하였다. 이렇게 과잉발현된 Proteinase K는 불용성 형태를 유지하여 재조합 대장균의 생존과 성장에 미칠 수 있는 위험성을 낮추었다.

목차 Contents

• 과제별 세부 집행내역...1
• I. 조성 금액...1
• II. 과제개발비 집행내역...1
• 『산학연 공동기술개발컨소시엄사업』최종보고요약서(초록)...7
• 『산학연 공동기술개발컨소시엄사업』개발결과의견서...9
• 표지...10
• 목차...11
• 과제개발 결과보고서...12
• 제1장 서론...12
• 제1절 Proteinase K의 용도...12
• 제2절 Proteinase K의 정제기술의 현황과 문제점...13
• 제2장 연구내용 및 방법...14
• 제1절 Proteinase K 생산균의 배양...14
• 제2절 Proteinase K 유전자의 크로닝...14
• 제3절 Proteinase K 유전자 과잉발현용 재조합 플라스미드 제조...14
• 제4절 재조합 대장균에서 과잉발현...15
• 제3장 사업성과...16
• 제1절 Proteinase K 유전자의 크로닝...16
• 제2절 Proteinase K 유전자의 과잉발현용 재조합 플라스미드 제조...22
• 제3절 재조합 대장균을 이용한 Proteinase K의 과잉 생산...24
• 제4장 결론 및 활용방안...27
• 제1절 Proteinase K의 유전자 확보...27
• 제2절 Proteinase K의 과잉발현용 재조합 대장균 개발...28
• 제3절 향후계획과 활용방안...28