초록 ▼

1. 최종목표
- DNA또는 RNA annealing 활성이 있는 단백질 발굴 및 성격 규명
- DNA또는 RNA증폭 시 민감도가 증가된 제품의 개발
2. 개발내용 및 결과
- DNA annealing 활성을 가진 단백질 분리
- DNA annealing 활성의 intrinsic 여부 확인
- DNA annealing 활성의 특성 분석
- RT-PCR의 효과 검증
3. 사업성과
= 기술적 성과
본 과제는 Mus81-Eme1 복합체의 nucleic acid annealing 활성을

1. 최종목표
- DNA또는 RNA annealing 활성이 있는 단백질 발굴 및 성격 규명
- DNA또는 RNA증폭 시 민감도가 증가된 제품의 개발
2. 개발내용 및 결과
- DNA annealing 활성을 가진 단백질 분리
- DNA annealing 활성의 intrinsic 여부 확인
- DNA annealing 활성의 특성 분석
- RT-PCR의 효과 검증
3. 사업성과
= 기술적 성과
본 과제는 Mus81-Eme1 복합체의 nucleic acid annealing 활성을 확인하고 이 활성을 응용하여 주형 RNA 또는 DNA와 primer DNA의 결합을 효과적으로 촉진시켜 역전사효소 또는 PCR효소가 더 잘 작용할 수 있는 것을 과학적으로 검증하려는 것을 연구 목표로 삼았다. 이러한 목표 달성은 자연적으로 새로운 원리에 입각한 경쟁력있는 RT 또는 PCR 제품의 상용화로 이어질 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위하여 여러 진핵생명체, 특히 인간과 효모의 Mus81-Mms4 복합체를 박테리아와 곤충세포에서 발현 정제하여 이들이 상보적인 DNA의 annealing에 미치는 영향을 조사하였다. 이 과제 수행기간 동안 다음과 같은 실험을 진행하였다.
1. 인간의 Mus81-Eme1 유전자 cloning 및 발현 vector 제조.
2. 인간의 Mus81-Eme1 발현 및 순수 분리
3. 효모의 Mus81-Mms4 유전자 cloning 및 대장균 발현 vector 제조
4. 효모의 Mus81-Mms4 곤충세포 발현 vector 제조
5. 효모의 Mus81-Mms4 대장균에서의 발현 및 순수분리
6. 효모의 Mus81-Mms4 곤충세포에서의 발현 및 순수분리
7. 인간의 Mus81 및 Eme1 subunit 발현 및 순수분리
8. 인간의 Mus81-Eme1 complex 중 Eme1의 DNA annealing 활성 확인
9. 인간의 Mus81-Eme1 complex에 의한 cDNA합성 촉진 확인
10. 인간의 Mus81-Eme1 의 DNA annealing 생화학적 활성 특성 규명
11. 대장균 유래의 강력한 DNA annealing 활성 확인
= 경제적 성과
이 과제는 새로운 원리의 원천성을 갖는 제품을 개발하기 위한 연구과제로 매우 도전적인 과제라고 할 수 있다. 비록 1년간의 연구개발비의 지원으로 연구를 수행하였지만 연구 성격상 다년간에 걸친 연구를 필요로 하기 때문에 본 회사는 앞으로 계속 연구 개발을 하고자 한다. 현재 연구를 진행 중이고 앞으로 1~2년간의 연구 수행이 필요하기 때문에 현 시점에서 구체적인 경제적인 성과는 기대할 수 없다. 하지만 연구의 성공적인 수행은 RT 및 PCR시장의 국내 및 국제적인 규모로 보면 매우 막대할 것이라고 기대된다.
= 사회적 성과(일자리 창출 등)
이 연구결과를 카이스트에서 이전받아 후속적인 제품개발을 수행하기 위하여 (주)엔지노믹스는 연구원 두명을 고용하였다.
4. 향후추진계획
과제의 많은 시간을 DNA annealing활성이 hMus81-Eme1 complex에 intrinsic한 활성인가를 검정하는 데 많은 시간을 할애하였다. 이것은 제안 과제의 핵심으로 이것이 옳게 검증되지 않으면 후속연구가 의미가 없어지기 때문이다. 이 결과 우리는 DNA annealing활성이 hMus81-Eme1 complex에 intrinsic한 것이라는 결론을 내릴 수 있었고 단백질에 의하여 DNA annealing이 매개된다는 것을 알 수 있었다. salt 민감성에 근거하면 annealing 기작은 단백질-DNA 복합체를 중간체 (intermediate)으로 하여 진행된다고 추정할 수 있다. 또한 subunit 활성을 분석함으로써 Mus81-Eme1 complex가 Eme1을 통하여 DNA와 결합을 하고 이 complex에 결합한 DNA는 상보적인 DNA와 더 용이하게 annealing된다고 할 수 있다. 또한 우리는 Mus81 또는 Eme1 순수분리 과정에서 E. coli 유래의 새로운 annealing활성이 존재함을 확인하였다. 각 subunit 순수분리과정에서 관찰된 이와 같은 활성이 Mus81-Eme1 complex에 있는 것과 동일한 것인지 아닌지는 비교 실험이 필요하다. 하지만 이런 새로운 발견으로 인해 우리는 보다 주위깊게 다시 한번 Mus81-Eme1 complex를 분리하고 교차 오염을 막기 위한 조건을 사용하여 glycerol gradient sedimentation단계에서 얻은 fraction을 분석한 결과 Mus81-Eme1뿐만 아니라 E. coli 유래의 annealing활성도 존재한다는 것을 확인하였다. E. coli 유래의 DNA annealing 활성은 더 뛰어난 상업적 응용이 가능한 단백질이 될 수 있어 이들 확인하기로 하였다. 현재 MALDI-TOF을 통해 확인된 가장 강력한 후보단백질은 ribosome 단백질로, 이들을 재조합단백질 제조 및 순수 분리하여 DNA annealing활성을 검증할 연구를 계획하고 있다. 이 단백질을 확인한 후에 역전사효소 반응 및 PCR반응에 어떠한 역할을 할 것인지 조사하고자 한다.

목차 Contents

• 최종보고서 제출서...1
• 지식재산권 출원.등록비 집행내역...2
• 사업비사용실적보고서...3
• Ⅰ. 총괄현황...3
• Ⅱ. 과제개발비 세부집행내역...3
• 개발 결과의견서...6
• 최종보고요약서(초록)...7
• 목차...9
• 제 1 장 서론...10
• 1.1 연구배경...10
• 1.2 연구의 중요성...12
• 제 2 장 과제개발 내용 및 방법...16
• 2.1 연구 목표...16
• 2.2 연구내용 및 범위...17
• 2.3 연구재료 및 방법...18
• 제 3 장 연구결과...26
• 3.1. Purification of the human Mus81-Eme1 complex...26
• 3.2. Identification of potential strand annealing activity of hMus81-Eme1...27
• 3.3 Kinetic analysis of strand annealing activity of hMus81-Eme1 complex...30
• 3.4 Annealing is sensitive to salt concentrations, a strong indication of protein involvement...31
• 3.5 hMus81-Eme1 complex can generate proper substrate for nuclease reaction by using strand annealing activity...33
• 3.6 Potential use of human Mus81-Eme1 for enhancement of RT-PCR reaction...33
• 3.7 Investigation of strand annealing activity of each subunit of the hMus81-Eme1 complex...35
• 3.8 Strand annealing activity of Mus81 complex is evolutionarily conserved...37
• 3.9 Identification of robust annealing activity derived from E. coli proteins...39
• 제 4 장 결론...39
• 4.1 Summary...39
• 4.2 향후계획 및 Discussion...41
• 제 5 장 참고 문헌...42