초록 ▼

- 돼지 흉막폐렴 예방을 위한 경구 백신 개발의 기초연구 실시
- 병원성 유전인자의 확보, 병원성 인자의 epitope 분석
- 항원 단백질을 발현 및 항체를 제작
- 점막면역계 targeting을 위한 ligand를 검색
- 면역 유도 효과를 높이기 위한 항원단백질의 발현량 증가 및 장 점막면역계 targeting strategy 적용
- 항원 발현 형질전환 효모 및 식용담배 생산
- 마우스 모델과 목적 동물 (돼지)에서 경구 백신의 효능을 확인
- 경구 백신 접종 후, A. pleuropne

- 돼지 흉막폐렴 예방을 위한 경구 백신 개발의 기초연구 실시
- 병원성 유전인자의 확보, 병원성 인자의 epitope 분석
- 항원 단백질을 발현 및 항체를 제작
- 점막면역계 targeting을 위한 ligand를 검색
- 면역 유도 효과를 높이기 위한 항원단백질의 발현량 증가 및 장 점막면역계 targeting strategy 적용
- 항원 발현 형질전환 효모 및 식용담배 생산
- 마우스 모델과 목적 동물 (돼지)에서 경구 백신의 효능을 확인
- 경구 백신 접종 후, A. pleuropneumonia 국내 야외 분리 균주로 공격 접종을 실시하여 백신의 효능 확인
- 개발된 형질전환 효모와 식용담배의 경구 투여에 의해, 돼지 흉막폐렴 원인균의 병원성 인자인 Apx에 대한 특이 항체가가 유의적으로 상승함을 확인하였고 임상증상, 조직병리학적 소견 및 생존율 역시 개선되는 효과를 확인

Abstract ▼

1. Basic Research to Develope a Protective Vaccine against Porcine Pleuropneumonia
A. Cloning of Virulence Factors and Analysis of Epitope
We have isolated and identified total 51 Actinobacillus pleuropneumoniae, which is a causative agent of porcine pleuropneumonia, from field material in Kor

1. Basic Research to Develope a Protective Vaccine against Porcine Pleuropneumonia
A. Cloning of Virulence Factors and Analysis of Epitope
We have isolated and identified total 51 Actinobacillus pleuropneumoniae, which is a causative agent of porcine pleuropneumonia, from field material in Korea. Multiplex PCR was established and the major virulence factors in standard 15 serotype of A. pleuropneumoniae were analysed with the method.
B. Expression of Antigens and Development of Antibodies
The epitope of ApxII, which is a major target antigen was analysed, and 5 different protein fragments of ApxII overlapping each other were cloned and expressed using E. coli system. Also antibodies against these proteins were developed and used for confirming whether the vaccine developed in this study works properly. The experiment detecting antigenicity and immunogenicity of each protein fragment shows that 5th fragment could be the most effective candidate to be expressed in transgenic yeast and tobacco.
C. Searching Ligands Targeting Mucosal Immune System
To stimulate mucosal immune system effectively, a method for increasing expression level and a targeting strategy for mucosal immune system were applied.
2. Development of a Protective Oral Vaccine against Porcine Pleuropneumonia
Transgenic yeast and tobacco expressing antigen have been developed and tested using experimental mouse model. To overcome immune-tolerance, different strategies for immunizing host were tested and confirmed by titration of Apx specific IgA and IgG in serum, saliva, nasal wash, intestine, and fecal samples. Also ability of oral vaccine protecting host from bacteria was verified by detecting amount of cytokines expressed and changes in immune cells after challenging the host to A. pleuropneumoniae, which was most pathogenic among the field isolates. Also, protective immunity in pigs was elevated by oral vaccination with transgenic yeast and tobacco; increased antibody titer against Apx, improved clinical and histopathological symptoms, and increased survival rate after the challenge.

목차 Contents

• 표지...1
• 최종보고서 초록...2
• 제출문...3
• 요약문...4
• SUMMARY...6
• CONTENTS...8
• 목차...11
• 제 1 장 서론...14
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...15
• 제1절 국외의 연구개발 실적...15
• 1. 외래 항원단백질의 식물체에서의 발현...15
• 2. 식물에서 발현된 항원단백질의 항원성 확인...16
• 3. 식물 경구백신의 적용 연구...16
• 4. 항원발현 효모를 이용한 경구백신...17
• 제2절 국내의 연구개발 실적...18
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...19
• 제1절 돼지 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자 및 항원 단백질 분석...19
• 1. 돼지 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자 분석...19
• 가. 돼지 흉막폐렴 원인균의 분리 및 동정...19
• 나. 돼지 흉막폐렴 원인균의 주요 병원성 인자 분석...19
• 2. 돼지 흉막폐렴 원인균 항원단백질 분석...20
• 가. ApxII 항원단백질의 epitope 분석...20
• 나. ApxII 항원단백질 절편의 항원성 검정...21
• 다. ApxII 항원단백질 절편의 면역원성 검정...21
• 제2절 Apx 항원단백질에 대한 항체 제조...22
• 1. ApxII 항원단백질에 대한 다클론 항체 제조...22
• 2. ApxII 항원단백질에 대한 단클론 항제 제조...23
• 제3절 Apx 항원단백질 발현 효모 형질 전환체 제조...23
• 1. ApxI, ApxII 항원단백질을 발현하는 형질 전환체 제조...24
• 2. LT-B-ApxII 융합 항원단백질을 발현하는 형질 전환체 제조...24
• 제4절 Apx 항원단백질 발현 식물 형질전환체 제조...25
• 1. 담배를 이용한 Apx 항원단백질 발현 식물 형질전환체 제조...25
• 2. 토마토와 상추를 이용한 Apx 항원단백질 발현 식물 형질전환체 제조...26
• 제5절 ApxII 항원단백질 발현 효모를 이용한 실험동물에서의 경구면역: 점막 면역 분석 기법 확립...26
• 1. ApxI 및 ApxII에 대한 IgG 및 IgA 항체가 측정...26
• 2. 면역 형성능 측정을 위한 cytokine 및 점막 세포 분석...27
• 제6절 ApxII 항원단백질 발현 식물을 이용한 실험동물에서의 경구면역...28
• 제7절 목적동물 (돼지)에서 흉막폐렴 모델의 확립 - 형질전환 효모...29
• 1. 실험돈 생산 및 사육...29
• 2. 형질 전환 효모의 경구 접종...30
• 3. Apx 특이 IgG 및 IgA 항체가 측정...30
• 4. 분변 내 yeast 및 동정...31
• 5. 경구 백신에 의한 방어능 평가...32
• 가. 실험돈의 건강상태 확인...32
• 나. 공격접종에 따른 임상증상 및 병리 해부학적 진단...32
• 다. 실험돈 폐의 병리, 조직학적 관찰...33
• 제8절 목적동물 (돼지)에서 흉막폐렴 모델의 확립 - 형질전환 담배...34
• 1. 형질 전환 담배의 경구 접종...34
• 2. Apx 특이 IgG 및 IgA 항체가 측정...34
• 3. 경구 백신에 의한 방어능 평가...35
• 4. 경구 백신에 따른 면역 기전 연구...35
• 제9절 항원의 점막면역계 전달을 위한 ligand 기능 검정...35
• TABLES and FIGURES...37
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...109
• 제1절 전문 학술지 논문 게재...109
• 1. 국내 (일반)...109
• 2. 국외 (SCI)...109
• 제2절 국내외 학술 발표...111
• 제3절 기타 (유용유전자, 형질전환체)...114
• 제5장 연구개발결과의 활용계획...115
• 제6장 참고문헌...116