초록 ▼

￮ 본 과제에서는 OECD 내분비계장애물질 검색시험법 프로그램 참여를 위하여 화학물질들의 내분비계장애작용 중 안드로겐 활성을 검색하기 위한 in vitro 안드로겐 수용체 전사활성시험법의 확립 및 검증 연구를 최종 목표하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
￮ 안드로겐 수용체 전사활성시험법을 위하여 안드로겐 수용체를 함유하는 사람 전립선암세포주인 22Rv1 세포에 reporter gene으로 pGL3-MMTV-Luc/Hygro plasmid를 영구 transfection 시켜 22Rv1/MMTV 세포를 구축하였다. 구축된 세포주는

￮ 본 과제에서는 OECD 내분비계장애물질 검색시험법 프로그램 참여를 위하여 화학물질들의 내분비계장애작용 중 안드로겐 활성을 검색하기 위한 in vitro 안드로겐 수용체 전사활성시험법의 확립 및 검증 연구를 최종 목표하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
￮ 안드로겐 수용체 전사활성시험법을 위하여 안드로겐 수용체를 함유하는 사람 전립선암세포주인 22Rv1 세포에 reporter gene으로 pGL3-MMTV-Luc/Hygro plasmid를 영구 transfection 시켜 22Rv1/MMTV 세포를 구축하였다. 구축된 세포주는 DHT 처리에 의하여 용량-의존적으로 luciferase 활성이 증가하였으며 1nM DHT 처리에 의하여 10배 내외로 luciferase 활성이 유도 되었다. DHT에 대한 반응성은 세포 모양의 변화없이 현재 43계대까지 6개월 이상 1nM DHT에 대한 fold induction이 10배 내외로 그대로 유지되었으며 유명한 항안드로겐 물질인 20uM bicalutamide에 의하여 DMSO 처리군 수준으로 저해되었다. Glucocorticoid인 dexamethasone 처리에 의하여 역시 용량의존적으로 luciferase 활성이 증가되었으며, glucocorticoid 수용체(GR) 저해제인 RU486과 bicalutamide 처리를 하였을 때 저농도에서는 GR에 의하여 luciferase 활성이 유도 되었으나 고농도에서는 안드로겐 수용체에 의하여 luciferase 활성이 증가되었다.
￮ 구축된 22Rv1/MMTV 세포의 특성과 안정성을 평가한 후 Steady-Glo luciferase kit를 이용하여 안드로겐 수용체 전사활성시험법의 최적화한 후 프로토콜을 구축하였다. 즉, 시험은 96well plate에 2x104 개의 22Rv1/MMTV E4세포를 seeding 한 후 2일간 배양하여 cell을 well에 완전히 부착시킨 후 day 3에 charcoal stripped FBS가 포함된 RPMI1640 media로 media를 교체하여 media에 안드로겐이 최소화되도록 한 상태로 24시간 incubation 하였다. Day 4에 확인하고자 하는 화합물을 1nM DHT가 포함된 media에 농도의존적으로 처리하고, 24시간 후 즉 day 5에 luciferase assay를 수행하여 얻은 측정값을 positive control로 처리하는 1nM DHT 처리군의 luciferase activity 측정값과 비교하여 상대적인 luciferase activity를 계산하였다.
￮ 주관기관인 고려대를 비롯하여 한국생명공학연구원과 한국한의학연구원 등 3개 시험기관이 참여하여 20종의 화합물에 대하여 안드로겐, 항안드로겐 및 세포독성에 대한 검증 시험을 실시하였다. 그 결과 안드로겐 작용에 대한 정확성은 3 기관 모두가 90% 이상을 나타내었으며 false positive는 3기관 모두 hydroxyflutamide에 대하여 나타났다. 항안드로겐에 대한 작용은 3기관 모두 85% 이상으로 나타났나, 20종의 물질 중 2종이 항안드로겐으로 확정하기 힘든 P/N 화합물의 판정 때문에 정확률이 85%로 낮아졌다. 각 기관의 intra CV 값은 agonist의 경우는 대부분 허용치인 10이하로 나타났으나 항안드로겐의 경우는 intra CV 값이 상대적으로 매우 크게 나타났다.그러나 기관간에 대한 inter CV값은 허용한계치인 20-25%가 넘었다.
￮ 따라서 본 과제에서 구축한 22Rv1 세포주를 이용한 안드로겐 수용체 전사활성시험법을 OECD에 제안하기 위하여 좀 더 다양한 시험물질을 이용한 시험 프로토콜에 대한 검증을 충분한 시간을 가지고 실시해야 할 필요가 있다.
￮ 본 과제에서 구축한 시험법은 저비용으로 또한 고속으로 안드로겐양/항안드로겐양 내분비장애 독성 스크리닝에 활용가능하며 OECD 내분비계 장애물질 검색시험법 프로그램에서 아직 안드로겐 수용체 전사활성 시험법이 검증되고 있지 않고 있으므로 본 연구결과를 바탕으로 OECD 내분비계장애물질 검색시험법 프로그램에 시험법 제안하여 국가간 내분비장애시험법 표준화 프로그램에 주도적으로 참여하여 국가 위상을 높일 수 있을 것이다.

Abstract ▼

￮ In order to propose the screening method to the endocrine disruptor screening program of OECD, the in vitro assay method of androgen receptor mediated transcriptional activation for screening the endocrine disruptor chemicals was established and verified in this assignment. After then by participa

￮ In order to propose the screening method to the endocrine disruptor screening program of OECD, the in vitro assay method of androgen receptor mediated transcriptional activation for screening the endocrine disruptor chemicals was established and verified in this assignment. After then by participating three institutions, 20 chemicals which were verified as tentative endocrine disruptors by Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) were screened using the established screening method.
￮ We established the 22Rv1/MMTV E4 cell line which were permanently transfeceted pGL3-MMTV-Luc/Hygro plasmid in androgen receptor positive human prostate cancer cell line, 22Rv1 cells. DHT was increased the luciferase activity in a dose dependent manner with around 10 folds at 1nM concentration in the 22Rv1/MMTV E4 cells anda well-known antiandrogen bicalutamide was inhibited the DHT induced luciferase activity to the level of DMSO treatment. It was maintained the fold induction by the treatment of 1nM DHT and cell morphology to over 43 passages which were more than 6 month periods.
￮ Assay protocol of androgen receptor mediated transcriptional activation activity for HTS level speed was established using Steady-Glo luciferase kit in 96 well plate. 2x104 of 22Rv1/MMTV E4 cells were seeded on a 96 well plate and incubated for 48 h to attach the cells. On day 3, cells were changed the media with the phenol free RPMI 1640 containing 5% charcoal stripped FBS. After 24h, 6 concentrations level of each chemical was treated to the cells for 24 h and assayed the luciferase activity. The relative androgenic activities of chemicals were calculated using the 1nM DHT-induced luciferase activity.
￮ 20 tentative endocrine disrupting chemicals were tested the androgenic and antiandrogenic activity and cytotoxicity in three institutions following the established assay protocol. in this project. The accuracy of androgenic activity in the results of three institutes was over 90% without the false negative. Hydroxyflutamide which ICCVAM classified as a negative in androgenic activity was evaluated as a positive in all three institutes. The accuracy of antiandrogenic activity was around 85% because the two P/N compounds (compound is hard to decide to positive or negative in antiandrogenic activity) containing among 20 chemicals were evaluated to positive or negative. In order to analyze the precision of the assay, coefficient of variation (CV) was determined using assay results from three institutes. Intra CV value for agonist was below 10% which is the maximal permissible limit, however, inter CV value among three institutes was over the maximal permissible limit which is 20-25%.
￮ These result suggested that the assay protocol need to be more validated for proposing to the endocrine disruptor screening program of OECD

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구결과보고서 요약문 ... 5
• Summary ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 제1장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 제2장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법 ... 16
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 24
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 50
• 제5장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 53
• 제6장 기타 중요변경사항 ... 54
• 제7장 참고문헌 ... 55
• 제8장 첨부서류 ... 57
• 총괄 연구과제 요약 ... 61