초록 ▼

사람 유래 간세포를 이용한 독성 및 약리평가에 대한 국내외 수요가 증가하고 있다. 한국인 고유의 약물대사 및 약물상호작용에 대한 연구기반 강화와 신약개발 인프라 강화를 위해서는 한국인 유래 간세포의 분리 배양기술의 확립과 이를 이용한 약물평가시험법의 개발 및 기술 전파가 요구된다.
미국이나 유럽의 경우에는 뇌사자의 이식부적합 기증간을 활용하여 약물대사 평가용 인체 간세포를 상업적으로 판매 공급하고 있으며, 동결보존된 인체 간세포의 경우에는 국내에서도 구입이 가능하다. 그러나, 주요 인체 간세포 공급업체가 보유하고 있는 간세포

사람 유래 간세포를 이용한 독성 및 약리평가에 대한 국내외 수요가 증가하고 있다. 한국인 고유의 약물대사 및 약물상호작용에 대한 연구기반 강화와 신약개발 인프라 강화를 위해서는 한국인 유래 간세포의 분리 배양기술의 확립과 이를 이용한 약물평가시험법의 개발 및 기술 전파가 요구된다.
미국이나 유럽의 경우에는 뇌사자의 이식부적합 기증간을 활용하여 약물대사 평가용 인체 간세포를 상업적으로 판매 공급하고 있으며, 동결보존된 인체 간세포의 경우에는 국내에서도 구입이 가능하다. 그러나, 주요 인체 간세포 공급업체가 보유하고 있는 간세포 중에는 아시아인 유래 조차 거의 없기 때문에 현재 한국인 고유의 약물대사를 배양간세포로 확인하기는 불가능한 상태이다.
본 연구에서는 활용 가능한 인체 간 조직원을 선정하여 획득 절차를 수립하고 이를 활용하여 간세포를 분리하고 다양한 배양 방법을 확립함으로서, 한국인 간세포를 활용하여 약물을 평가할 수 있는 기반을 수립하는 것이다.
인체 정상 간 조직은 기관윤리위원회의 승인과 환자 동의 후에 간절제 수술 시에 얻어지는 부분 간으로부터 획득하였으며 간세포 분리에 적합한 간 조직의 선정 기준을 확립하였다.
간 조직 획득 과정에서 상온 허혈 시간은 30분 이내로 최대한 단축하여야 하며, 상대적으로 어린 연령이나 선종(adenoma)과 같은 양성종양으로 인해 절제된 간에서 얻어진 경우에 간세포 수율이나 품질이 우수한 것으로 나타났다.
간세포는 조직 절제면의 노출된 2-3개의 혈관을 통하여 2단계 효소 관류법을 이용하여 분리하였다. 분리된 간세포는 수입되는 동결보존 간세포와 동등한 수준의 생존율과 부착 능력을 나타냈다. 주요 간 특이적인 기능을 비교한 결과에서도 본 연구를 통하여 분리된 간세포는 상용 간세포와 동등한 배양 품질을 나타내었다. 배양 품질 지표 중 부착율, 요소분비, 암모니아제거 및 CY P1A 2가 평가 지표로 유용한 것으로 나타났다. 또한, 장기간(long term) 약물 반응을 시험하기 위한 배양법으로서 샌드위치 배양법과 구상체 캡슐방법을 수립하였다.
Acetaminophen을 사용한 약물독성 시험에서 세포형태, MTT, A nnexin-EthD staining, 요소 분비, 알부민 분비가 유용한 간독성 평가 지표로 활용될 수 있는 것으로 나타났고, 유전자 발현 평가 시험 결과 HMOX 1, BHM T, CA 3, HA O2, RB1, THRSP 및 해당 약물의 대사 관련 사이토크롬 P450이 유용한 지표로 사용될 수 있음을 알았다.
간세포 분리와 배양방법은 SOP와 자세한 교육 동영상을 제작하여 관련 연구자들이 해당기술을 활용할 수 있도록 하였고, 간독성 평가 관련 시험 방법의 자세한 SOP를 제공하여 기술 확산에 도움이 될 것으로 사료된다.

Abstract ▼

Need for human hepatocytes have been increased for toxicity test and pharmacological evaluation for new drugs development. To strengthen the research on drug metabolism and drug interaction especially inherent in Korean, establishment of hepatocyte isolation technique and culture method is on demand

Need for human hepatocytes have been increased for toxicity test and pharmacological evaluation for new drugs development. To strengthen the research on drug metabolism and drug interaction especially inherent in Korean, establishment of hepatocyte isolation technique and culture method is on demand, and development of drug test method and its propagation is needed as well.
In USA and EU, human hepatocytes originated from donated liver which not suitable for transplantation were commercially supplied for drug metabolism evaluation. Cryopreserved form of the hepatocytes are available in Korea as well. However, in case of Asian-originated human hepatocytes, almost all of the international suppliers do not have enough stocks of them, so that the drug test using human hepatocytes originated from Korean is almost impossible.
Therefore, the purpose of this study is to establish the standard procurement procedures of donated liver organs, secondly to develop hepatocyte isolation and culture method, and lastly effective drug test methods using the human hepatocytes.
Donated human liver tissues were obtained after IRB(Institutional Review Board) approval and informed consent of donor. We defined the screening criteria of donated liver organs, such as warm ischemic time, donor's age and cause of hepatectomy, etc.
Hepatocytes were isolated with two-step collagenase perfusion through exposed several veins on liver tissue's amputated side. As a result, the isolated hepatocytes showed equivalent viability and platability compared with the cryopreserved commercial human hepatocytes, and the major hepatic functions of the hepatocytes also analogous with the commercial hepatocytes. As the major indices of hepatocyte culture qualities, platability, urea secretion, ammonia removal and CYP1A2 activities appeared to be useful. We established several culture methods for long-term drug test such as sandwich culture and spheroid capsule culture.
In the result of acetaminophen toxicity test, cell morphology, MTT conversion, Annexin-EthD staining, urea secretion, and albumin secretion appeared to be useful toxicity indices. Besides, in relevant with gene expression with acetaminophen-induced liver injury, HMOX1, BHMT, CA3, HAO2, RB1, THRSP and CYP P450 enzymes related with the drug metabolism appeared to be useful drug evaluation indices.
We did a education movie clip to let many researchers know the human hepatocyte isolation and culture method, and provided detailed SOPs of hepatocyte isolation and hepatotoxicity tests for the technology propagation..

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• Ⅰ. 총괄연구개발과제 요약문 ... 6
• 1. 국문요약문 ... 6
• 2. 영문요약문 ... 8
• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
• 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 10
• 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ... 15
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 20
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 56
• 제5장 총괄주요연구 변경사항 ... 57
• 제6장 총괄참고문헌 ... 58
• 제7장 총괄첨부서류 ... 60
• Ⅲ. 제(1)세부연구개발과제 연구결과 ... 117
• 제1장 세부연구개발과제의 요약문 ... 117
• 제2장 세부연구개발과제의 목적 ... 120
• 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ... 122
• 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ... 127
• 제5장 세부참고문헌 ... 155
• Ⅲ. 제(2)세부연구개발과제 연구결과 ... 157
• 제1장 제(2)세부 연구개발과제 요약문 ... 157
• 제2장 세부연구개발과제의 목적 ... 160
• 제3장 세부연구개발과제의 내용 및 방법 ... 161
• 제4장 세부연구개발과제의 결과 및 고찰 ... 162
• 제5장 세부참고문헌 ... 170