초록 ▼

I. 연구목표
I.1 최종연구목표
전 세계인구의 약 3-5%가 난치병인 간암을 일으키는 C형간염바이러스 (Hepatitis C Virus, HCV)에 의해 감염된 상태이다. 급성간염환자의 경우, 임상적인 증상을 나타내지 않으며, 환자의 약 85%가 인체 내에서 바이러스를 제거하지 못하고 만성간염으로 발전해 간다. 만성간염환자의 경우, 약 20-30%가 간경화 및 간암으로 발전한다. 1989년 HCV의 염기서열이 밝혀진 이후, 많은 연구에도 불구하고 지금까지 항바이러스성 치료제나 예방백신개발에 필수적인 조직배양기술이 개발되

I. 연구목표
I.1 최종연구목표
전 세계인구의 약 3-5%가 난치병인 간암을 일으키는 C형간염바이러스 (Hepatitis C Virus, HCV)에 의해 감염된 상태이다. 급성간염환자의 경우, 임상적인 증상을 나타내지 않으며, 환자의 약 85%가 인체 내에서 바이러스를 제거하지 못하고 만성간염으로 발전해 간다. 만성간염환자의 경우, 약 20-30%가 간경화 및 간암으로 발전한다. 1989년 HCV의 염기서열이 밝혀진 이후, 많은 연구에도 불구하고 지금까지 항바이러스성 치료제나 예방백신개발에 필수적인 조직배양기술이 개발되지 않은 상태이다. 따라서, HCV의 감염으로 인한 간암의 예방 및 치료를 위해서 HCV의 조직배양기술 개발이 매우 시급한 연구과제이다. 따라서, 본 연구의 최종목표는 간염, 간경화 및 난치병인 간암의 주원인인 병원성 HCV에 효과적인 항바이러스성 신약물질개발을 촉진할 수 있는 치료제 탐색시스템을 개발하는 것이다.
I.2 세부연구목표
본 연구의 최종연구목표를 효과적으로 수행하기 위한 세부연구목표는 다음과 같다.
•HCV의 복제를 조절하는 viral RNA sequence를 겨냥한 치료제 탐색시스템 개발.
•HCV의 복제에 필수적인 viral protein을 겨냥한 치료제 탐색시스템 개발.
•개발된 치료제 탐색시스템을 이용하여 몇몇 항바이러스성 신약물질 평가.
II. 연구결과
최근 본 연구실에서 HCV와 매우 유사한 일본뇌염바이러스 (Japanese encephalitis virus, JEV)의 infectious cDNA molecular clone을 세계최초로 합성하는 데 성공하였다. 따라서, JEV의 reverse genetics system을 이용하여 HCV/JEV chimeric virus를 재조합하여 생산함으로써, JEV의 세포배양기술을 이용하여 HCV에 대한 항바이러스성 치료제 탐색시스템으로 개발하고자 하였다. 세부적인 연구개발내용 및 결과는 크게 다음과 같이 세 가지로 요약할 수 있다.
II.1 HCV의 복제를 조절하는 viral RNA sequence를 겨냥한 치료제 탐색시스템 개발: HCV 게놈 RNA의 자가복제 및 전사와 바이러스 단백질의 발현은 HCV RNA 게놈 양쪽 말단부위에 자리잡고 있는 cis-acting viral sequence인 5‘ 및 3’ NTR에 의해서 조절된다. 또한 이들의 염기서열은 지금까지 분리된 많은 분리주들 간에 차이가 크지 않아 항바이러스성 치료제 개발의 타겟으로 적합하다. 본 연구에서는 이런 HCV의 RNA sequence를 항바이러스성 치료제 개발의 타겟으로 삼아 후보물질을 탐색할 수 있는 시스템을 개발하는 데 성공하였다. 즉, HCV는 지금까지 세포배양기술이 결여된 상태였으므로 HCV와 진화적으로 매우 유사한 JEV의 세포배양기술을 이용하여 HCV의 5‘ 및 3’ NTR의 염기서열을 가진 HCV/JEV chimeric virus 를 합성하는 데 성공하였다. 합성된 HCV/JEV chimeric virus는 JEV 5‘NTR 또는 JEV 3’NTR이 HCV 5‘NTR 또는 HCV 3’NTR로 완전히 대체된 경우와 JEV 5‘NTR와 HCV 5‘NTR 또는 JEV 3‘NTR와 HCV 3‘NTR이 일련으로 나열된 경우의 여러 가지 형태로 합성하였다. 합성된 HCV/JEV chimeric virus는 일본뇌염바이러스에 민감성을 나타내는 세포주들 모두에서 자가복제를 왕성하게 나타내었으나, 자가복제과정에서 삽입된 HCV sequence의 일부분을 결절 (deletion)하는 유전학적 불안정성을 나타내었다. BHK-21 세포에서 여러 차례의 계대배양을 통해서 얻어진 80여개의 독립된 HCV/JEV chimeric virus pseudorevertant들의 염기서열을 분석함으로써, 결절부위를 정확히 mapping하는 데 성공하였고, 이들의 염기서열을 infectious cDNA molecular clone상에 재조합함으로써 유전학적으로 안정된 HCV/JEV chimeric virus을 생산하는 데 성공하였다. 따라서, 본 연구결과 얻어진 HCV/JEV chimeric virus을 사용하여 HCV의 5‘ 및 3’ NTR을 타겟으로 한 새로운 항바이러성 치료제 후보물질의 효과를 세포 내에서 빠른 시간 내에 high-throughput 방식으로 스크리닝할 수 있을 것으로 기대된다.
II.2 HCV의 복제에 필수적인 viral protein을 겨냥한 치료제 탐색시스템 개발: HCV의 자가복제 및 전사, 번역에 필수적인 cis-acting RNA sequence 뿐만 아니라, HCV의 바이러스 단백질을 타겟으로 치료제 탐색시스템을 개발하고자 하였다. HCV는 viral receptor가 세포막에 자리잡고 있는 ligand에 binding함으로써 감염이 시작된다. 이와 같은 바이러스 감염의 초기단계를 항바이러스성 치료제개발의 목표로 삼아 치료효과가 있는 small molecule과 같은 후보물질들을 탐색할 수 있는 시스템을 개발하고자 하였다. 먼저 본 연구에서는 HCV의 구조단백질들을 결절시켰으나, 스스로 자가복제를 할 수 있는 3개의 독립된 HCV viral replicon (pHCVRep/BB1, pHCVRep/BB3 및 pHCVRep/BB7)을 자체적으로 합성하였는 데 성공하였다. 둘째로, JEV의 full-length infectious cDNA로부터 HCV의 구조단백질 (C, E1, E2)을 발현할 수 있는 JEV viral replicon을 합성하였다. 또한 HCV의 구조단백질들을 JEV viral replicon pJEVrep/NS1으로부터 발현하였다. 또한 HCV viral replicon은 JEV viral replicon으로부터 발현된 HCV 구조단백질의 trans-complementation system을 통해서 viral replicon particle을 생산하는 데 성공하였다. 하지만, HCV viral replicon particle내의 replicon genome에서 발현되는 luciferase activity가 <100 RLU정도로 나타났으며, 이 수치는 생산되는 viral replicon particle의 효율이 매우 낮음을 의미한다. 따라서 실질적으로 스크리닝 시스템으로 사용되기 위해서는 앞으로 생산 효율을 높이기 위한 연구가 선행되어야 할 것으로 사료된다.
II.3 개발된 치료제 탐색시스템을 이용하여 몇몇 항바이러스성 신약물질 평가: 본 연구를 통해서 합성된 HCV의 5‘ 및 3’ NTR을 가진 HCV/JEV chimeric virus의 세포배양기술을 이용하여 HCV 5' 및 3‘ NTR을 타겟으로 각각 3개씩의 antisense oligonucleotide를 이용하여 본 시스템을 평가하였다. 분석결과, HCV/JEV chimeric virus의 5’ NTR의 translation initiation site를 타겟으로 한 antisense oligonucleotide와 HCV 3' NTR의 X region을 타겟으로 한 antisense oligonucleotide가 감염된 세포로부터 progeny virus의 생산을 각각 50-60% 감소시킴으로써 좋은 항 바이러스 효과를 얻을 수 있었다. 본 실험을 통해서 antisense oligonucleotide뿐만 아니라, 화학적으로 합성이 가능한 다양한 종류의 small molecule들을 본 연구결과 구축 된 시스템을 사용하여 HCV에 대한 항바이러스 효과를 빠르고 쉽게 스크리닝할 수 있다는 것을 증명하였다. 본 연구결과 개발된 surrogate system을 사용하여 다양한 종류의 chemical library를 스크리닝함으로써, 앞으로 HCV에 대한 항바이러스 효과를 가진 후보물질을 빠른 시간 내에 도출할 수 있을 것으로 기대한다.
III. 기대효과 및 활용방안
•항바이러스성 치료제 탐색시스템은 C형간염바이러스에 대한 신약물질들을 최소한의 비용으로 빠른 시간 내에 개발을 가능하게 한다.
•C형간염바이러스로 인한 전 세계인구의 약 3-5% 정도인 급성간염환자를 치료할 수 있다.
•C형간염바이러스의 감염으로 인한 간암발병을 막을 수 있다.
•C형간염 보균자를 치료함으로써 간암으로 진행되는 더 이상의 확산을 막을 수 있다.
•안전하고 우수한 치료제 개발을 통한 국민건강을 보장할 수 있다.
•신약물질 개발을 통해 제약산업의 국제적 경제력을 강화할 수 있다.
•C형간염바이러스의 예방백신개발에도 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼

I. Overall Research Goal
I.1 Research Goal
About 3-5% of world population has been infected with the hepatitis C virus (HCV), which is capable of causing liver cancer. Most of acute infection is asymptomatic and about 85% of patients cannot remove the virus from the body so that they are devel

I. Overall Research Goal
I.1 Research Goal
About 3-5% of world population has been infected with the hepatitis C virus (HCV), which is capable of causing liver cancer. Most of acute infection is asymptomatic and about 85% of patients cannot remove the virus from the body so that they are developed to chronic hepatitis. In case of chronic hepatitis, approximately 20-30% of the patient has experienced liver cirrhosis and carcinoma in the later stage. Since the nucleotide sequence of HCV has been discovered, there is no cell culture system to be able to facilitate the developement of antiviral compounds and vaccines for this pathogen. Consequently, the development of cell culture system for HCV is one of the research priorities for the purpose of prevention and therapeutics against this pathogen. Therefore, our overall research goal is to develop screening systems to facilitate the development of antiviral therapeutic compounds effective against HCV infection.
I.2 Research objectives
Three research objectives to accomplish our research goal is as follows.
•A screening system targeting at cis-acting viral RNA sequences, required for HCV replication
•A screening system targeting at trans-acting viral proteins, required for HCV replication
•Evaluations of some antiviral compounds using a screening system developed above
II. Results
For the first time, we have recently established a reverse genetics system for JEV by constructing the infectious cDNA molecular clone for this pathogen, which is the most closely related to HCV. In this study, we generated a variety of HCV/JEV chimeric viruses using the reverse genetics system of JEV, and we took advantage of cell culture system for HCV/JEV chimeric viruses in order to develop screening systems for effective antiviral compounds against HCV. The results of this study has been summarized below.
II.1 A screening system targeting at cis-acting viral RNA sequences, required for HCV replication: The replication, transcription, and translation of HCV genomic RNA is regulated by cis-acting viral RNA sequences localized at both termini of the genomic RNA, designated as 5' and 3' nontranslated regions (NTRs). These sequences are highly conserved in all HCV isolates, which makes a desirable target for the development of antiviral compounds against this pathogen. In this study, we have successfully developed screening systems targeting at this cis-acting RNA elements required for HCV replication. For this goal, we rationally designed and engineered a variety of HCV/JEV chimeric viruses containing HCV 5' and 3' NTRs, and we successfully propagated this chimeric viruses using permissive cells for JEV. HCV/JEV chimeric viruses were generated by replacing JEV 5' and 3' NTRs with HCV 5' and 3' NTRs, respectively, arranging JEV 5'NTR and HCV 5'NTR in a row, or engineering JEV 3'NTR and HCV 3'NTR in a row. All of these synthesized HCV/JEV chimeric viruses were actively replicated in all of permissive cells for JEV, but showed some genetic instability, resulted in deletions in inserted HCV sequences of various sizes. We obtained a total of >80 independent pseudorevertants by serially passaging HCV/JEV chimeric viruses on BHK-21 cells. By sequencing analysis, we mapped the precise regions of each deletion in the genome. Subsequently, we reconstructed the identified deletions in the infectious cDNAs of each corresponding HCV/JEV chimeric cDNA and produced the recombinant chimeric viruses. Therefore, a genetically stable HCV/JEV chimeric viruses containing HCV 5' and 3' NTRs in the context of JEV genomic RNA will allow us to rapidly screen a large volumn of chemical library to search for the effective antiviral compounds to be able to inhibit HCV replication.
II.2 A screening system targeting at trans-acting viral proteins, required for HCV replication: In addition to cis-acting RNA elements required for HCV replication, we attempted to develop a screening system targeting at HCV proteins. HCV begins to infect permissive cells by binding of the viral receptor to a cellular ligand(s). By targeting at the early stage of HCV viral life cycle, we made substantial efforts to develop a screening system for antiviral compounds including small molecules, which is capable of blocking viral infection. First, we successfully constructed three self-replicating HCV viral replicons (pHCVRep/BB1, pHCVRep/BB3 and pHCVRep/BB7) by deleting the viral structural proteins (C, E1, and E2). Secondly, we generated a panel of JEV viral replicons by removing the viral structural proteins from the full-length infectious JEV cDNA and used them as heterologous gene expression vectors for the expression of HCV structural proteins. Among several JEV viral replions, we confirmed the expression of HCV structural proteins from JEV viral replicon pJEVrep/NS1. Additionally, these HCV viral replicon systems were further elaborated by trans-complementation of HCV structural proteins derived from the JEV viral replicon pJEVrep/NS1, which produced HCV viral replicon particles. However, the luciferase activity expressed from the replicon genome of HCV viral replicon particles was estimated to be approximately <100 RLU, indicating that the yield of HCV viral replicon particles appeared to be too low to use this system for genetic analysis. Therefore, further investigations to improve the yield of HCV viral replicon particle production is needed.
II.3 Evaluations of some antiviral compounds using a screening system developed above: By use of HCV/JEV chimeric viruses containing HCV 5' and 3' NTRs generated in this study, we evaluated whether 6 antisense oligonucleotides targeted at HCV 5' and 3' NTRs are able to inhibit the replication of the chimeric viruses in cell culture system. As a result, about 50-60% reduction in the production of chimeric progeny virus was observed with two antisense oligonucleotides; one complementary to the viral AUG initiation site and the other complementary to the X region of HCV 3'NTR. These results verified HCV/JEV chimeric viruses as a rapid and valuable screening system for effective antiviral compounds against HCV not only antisense oligonucleotides but also possibly small molecules. Thus, our system will provide a useful tool to identify several promising candidates for antiviral compounds against HCV infection by screening a large volume of chemical library using our surrogate system.
III. Effectiveness and Practical Applications
•Possible for the rapid identification of promising antiviral compounds for HCV infection using antiviral screening systems developed in this study.
•Possible to treat about 3-5% of world population acutely infected with HCV.
•Possible to prevent liver carcinoma by prevention of HCV infection.
•Possible to low the incidence of liver carcinoma by treatment of chronic HCV patients.
•Possible to improve health care by development of safe and effective anti-HCV compounds.
•Possible to enhance international competitiveness of domestic pharmaceutical industry.
•Possible to contribute the development of antiviral vaccines against HCV.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 7
• 연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 12
• 3. 연구개발과제의 연구개발결과 ... 15
• 4. 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 30
• 5. 연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 32
• 6. 연구개발과제의 활용계획 ... 37
• 7. 참고문헌 ... 38
• 8. 첨부서류 ... 42