보고서 정보
주관연구기관 |
농림수산검역검사본부 |
연구책임자 |
탁동섭
|
참여연구자 |
김민정
,
손현주
,
이윤희
,
김효진
,
예정용
,
김찬란
,
정혜영
,
최영표
,
이주희
,
이세영
,
최강석
,
조인수
,
주이석
,
권창희
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2008-12 |
과제시작연도 |
2008 |
주관부처 |
농림수산식품부 |
과제관리전문기관 |
국립수의과학검역원 National Veterinary Research and Quarantine Service |
등록번호 |
TRKO201200010298 |
과제고유번호 |
1545000597 |
사업명 |
수의과학기술개발연구 |
DB 구축일자 |
2013-04-18
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키워드 |
변형프리온.항원결정부위.형질전환 세포주.antigenic determinant.monoclonal antibody.PrPsc.cell.
|
초록
▼
□ 세부과제명: 변형프리온단백질($PrP^{sc}$)의 항원결정부위분석
가. 6종의 프리온 단백질 펩타이드 절편 합성
- ELK73-88, ELK94-104, ELK139-155, ELK152-168, amyloid 1- 2
나. 6종 단백질 펩타이드별 면역원성 조사
- 후보물질별 면역항체 생산(Knock out mouse)
◦ ELK73-88, ELK94-104, ELK139-155, ELK152-168(1:3,200이상의 항체수준 형성)
◦ amyloid 1과 2 : 낮은 면역
□ 세부과제명: 변형프리온단백질($PrP^{sc}$)의 항원결정부위분석
가. 6종의 프리온 단백질 펩타이드 절편 합성
- ELK73-88, ELK94-104, ELK139-155, ELK152-168, amyloid 1- 2
나. 6종 단백질 펩타이드별 면역원성 조사
- 후보물질별 면역항체 생산(Knock out mouse)
◦ ELK73-88, ELK94-104, ELK139-155, ELK152-168(1:3,200이상의 항체수준 형성)
◦ amyloid 1과 2 : 낮은 면역원성 확인
다. Elk PrP 아미노산 서열중 PrP knockout 마우스에서 면역원성이 인정된 4개 부위에 대한 단클론항체 생산
- 139-155 (4종) :사슴, 소, 양, 염소, 마우스 반응성
- 152-168 (9종) : 사슴, 양, 마우스 반응성 (소와 감별)
- 73-88 (9종) : 사슴, 소, 양, 염소, 마우스 반응성
- ELK 98-113(6H3) : 사슴, 소, 염소, 마우스($PrP^{sc}$) 반응성, 마우스 $PrP^{C}$와는 반응성 없음
- Bo150-169(N18-5) : 소 PrP에만 반응
라. Elk PrP 합성펩타이드를 이용한 PrP knockout 마우스에서 생산된 단클론항체의 특성조사
- 73-88 펩타이드 유래 단클론항체(4H90 등 11종)
◦ PK처리시 변형프리온과의 반응성 상실 확인
- 축종별 프리온단백질에 대한 반응성 조사
◦ 공통적으로 닭유래 프리온단백질에는 무반응성
◦ 73-88 펩타이드 유래 단클론항체(5H10) : 기니픽의 정상 프리온과는 반응성이 없고, 기타 축종 소, 사슴, 염소 등의 정상프리온과의 반응성 확인
- GdnScN 농도(변성조건)에 따른 항체 반응성
◦ GdnScN 농도에 따른 항체별 차이는 관찰되지 않았음
: 단, 73-88 펩타이드 유래 단클론항체는 ELISA 반응이 거의 없음
- 소해면상뇌증(BSE) 및 사슴만성소모성질병(CWD)에 특이적으로 반응하는 N18-5와 8E64 항체는 목적동물에서는 변형프리온의 감별이 가능하나 마우스에서 계대된 BSE와 CWD의 변형프리온에는 모두 반응하여 감별이 않되는 특징을 갖음 (종특이 특성확인)
마. Opti Prep을 이용한 프리온단백질 정제
- OPTI Prep 정제 결과 : 변형프리온(마우스 유래 BSE, CWD, Scrapie)은 5~9번 분획에서 검출됨을 확인
바. 프리온 항체를 이용한 항원 결정부위 분석
- Pepspot membrane을 이용한 단클론항체의 프리온 에피톱 반응부위 분석
◦ 7B40, 7B5 단클론항체 : YEDRYY(aa 148-153)
◦ 8E63 단클론항체 : NMYRYP (aa 156-161)
: 엘크와 동일한 소의 부위(NMHRYP)를 비교한 결과 엘크의 Y(tyrosine)와 소의 H(Histidine)이 상이함을 발견됨
◦ 73-88유래 항체(5H10, 9F56) : WGQP (aa76-79/84-87)
◦ 8E63 단클론항체는 BSE 변형프리온과는 웨스턴블롯상의 반응성이 없는 특징 갖음
□ 세부과제명: 프리온 형질전환 특수세포주 개발
가. 특수세포주 작성을 위한 후보세포주 선발
- 포유동물유래 후보 세포주 확보(7종/20종 $PrP^{C}$ 발현)
- 세포주별 프리온 단백질에 대한 유전자 다형성 분석
- Single cell cloning 법에 의한 $PrP^{C}$ 발현 ELK 세포주 clone 선발
- 38종의 초대 배양 사슴뇌세포 재선발
나. 세포주 감염조건 및 정상프리온의 변형프리온로의 변환율 조사
- $PrP^{CWD}$WD 세포감염 결과
◦ 1차 감염 : 5개 세포주 (감염 4~5대 후 검사) : ELISPOT과 웨스턴블롯 결과 음성
◦ 2차 감염 : 10개 세포주 (감염 4대 후 검사) : ELISPOT과 ELISA 결과 6개주 양성 확인
◦ 계대별 $PrP^{CWD}$ 지속감염능 조사 : 6대 계대 이후 지속감염 세포 미확보
- 감염비율이 높은 con-11(ELK-21) 세포를 클로닝하여 144개의 세포클론에 0.1% CWD 뇌유제액을 접종하고, 배지 조성에 따른 변환율 조사 (ELISPOT)
◦Ⅰ. 20%FBS, PMA(100ng/ml) : 25.7%(양성 세포 37개)
◦ Ⅱ. 20%FBS, PMA(100ng/ml), 0.5% Elk plasma : 33.3%(양성 세포 48개)
◦ Ⅲ. 20%FBS, 0.5% Elk plasma : 15.3% (양성 세포 22 개)
◦ Ⅳ. 20%FBS : 7.6% (양성 세포 11개)
다. 감염 세포주 작성
- Ⅰ~Ⅳ 조성배지에서 모두에서 양성을 나타낸 CWD 감염 양성클론을 재클로닝한 결과
24.2%(19/66 clones)의 양성클론을 확인함
라. Lentivirus expression system을 이용한 프리온단백질 발현
- con-11 세포에 정상프리온을 3종류의 형태로 발현
◦ 정상프리온 형태별 유전자 확보 및 벡터삽입 유전자 확인
◦ 선발세포에 감염성 Lentivirus 접종 및 감염세포 클로닝 완료
Abstract
▼
In order to produce a monoclonal antibodies (mAab) panel for research on properties of transmissible spongiform encephalopathy (TSE) such as Bovine spongiform encephalopathy (BSE), Chronic wasting disease (CWD) and Scrapie, we immunized prion protein(PrP) knock-out mice with synthetic peptides based
In order to produce a monoclonal antibodies (mAab) panel for research on properties of transmissible spongiform encephalopathy (TSE) such as Bovine spongiform encephalopathy (BSE), Chronic wasting disease (CWD) and Scrapie, we immunized prion protein(PrP) knock-out mice with synthetic peptides based on the amino acid sequence of cervine PrP and characterized immunological properties of mAbs. Twenty seven mAbs were obtained as follows; 7 against Elk73-88, 11 against Elk139-155 and 9 against Elk152-168. These new mAbs were all IgG1 isotypes. We characterized these mAbs together with two mAbs produced previously in our lab. Based on ELISA results, mAbs were divided into two groups, one recognizing own immunogen peptide only and the other reacting with own immunogen peptide and recombinant Deer PrP. Unfortunately, mAbs recognizing only own immunogen could not react with any other PrP in WB. Therefore we excluded those mAbs. Species-specificity was examined by WB with brain homogenates of mouse, sheep, goat, elk and cattle. The reactivity of brain homogenates were confirmed by commercial mAb 6H4 (Prionics, Switzerland) as a reference. From WB results, mAbs were divided into three groups again, the first group recognizing all species PrP tested on above-mentioned animal brain homogenates and the second not reacting with bovine PrP, finally mAb N18-5 recognized only bovine PrP. The species-specificity was observed consistently in WB with BSE, Scrapie and CWD reference materials. To analysis the epitopes of Mabs, we prepared the PEPSPOT membrane to have an array of 98 overlapping synthetic peptides, corresponding to residues 22-227 of cervine PrP, 12 mer peptide shiffed 2 amino acids. Monoclonal antibody 7B5, 8E63 and N18-5 reacted with YEDRYY, NMYRYD and FGND. Those species specificity was explained by different amino acid sequences of the epitope regions between species.
To develope in-vitro CWD pathogen culture model, we tried to select appropriate candidate cell lines from commercially available ones and generated primary Elk brain cell lines. And also the expression of cellular prion protein(intact Elk $PrP^{C}$, GPI-truncated Elk $PrP^{C}$ and GPI-truncated & TR anchor fused Elk $PrP^{C}$) in cells was carried out. For this strategy, we selected twenty existing mammalian origin commercial cell lines and confirmed the prion genes and prion protein expressions from the seven cells including MDBK, Vero and etc. And also we obtained thirty-eight primary cell lines from the 2 day-old Elk brain. Six primary cell lines were confirmed to be infective by ELISOPT, however became negative after six cell passages. The DT-C-C21 cell which was the highly sensitive to CWD infection, was cloned and selected one hundred forty four clones inoculated with 0.1% CWD brain homogenates.
The conversion rate to different media conditions were investigated. We have gotten 33.3% conversion rate with the DMEM/F12 medium supplemented with 20% FBS, PMA (100ng/ml) and 0.5% Elk plasma. Finally, we expressed the 3 types of cellular prions in DT-C-C21 cell to have high sensitivity in abnormal prion infection. Infectivity of these cell lines will be conducted in the nearest future.
목차 Contents
- 연구과제 최종결과보고서 Final Report (FR) ... 1
- 연구과제 최종결과보고서 ... 4
- Ⅰ. 연구배경 및 목표 ... 4
- 1. 연구배경 ... 4
- 2. 연구최종목표 ... 5
- 3. 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 5
- Ⅱ. 연구방법 및 수행전략 ... 6
- 1. 연구재료 ... 6
- 2. 연구방법 및 전략 ... 6
- Ⅲ. 연구결과 ... 6
- 1. 변형프리온단백질의 (PrPsc)의 항원결정부위 분석 ... 6
- 2. 프리온 형질전환 특수 세포주 개발 ... 14
- Ⅳ. 연구결과요약 ... 19
- 1. 세부과제명: 변형프리온단백질(PrPsc)의 항원결정부위분석 ... 19
- 2. 세부과제명: 프리온 형질전환 특수세포주 개발 ... 20
- Ⅴ. 고 찰 ... 20
- Ⅵ. 참고문헌 ... 22
- Ⅹ. 영문초록 ... 24
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