초록 ▼

"해외유입 및 법정 기생충질환의 고감도 및 첨단 진단 표준화" 과제는 현재 국내에 진단방법이 적립되어 있지 않은 포충증, 유극악구충증, 톡소포자충증과 개회충증의 고감도 및 표준적인 진단 기준을 확립하는데 그 목적이 있다.
제1세부과제: 포충증의 표준 진단법 확립 및 효능 검증
이 연구는 포충증 환자들의 혈청학적 진단을 위해 표준화된 ELISA 방법을 확립하는 것을 목적으로 한다. 이를 위하여 우즈베키스탄으로부터 자연 감염된 양의 간 또는 폐에서 포충(hydatid cyst)을 분리하여 낭액 (cystic fluid)을 채

"해외유입 및 법정 기생충질환의 고감도 및 첨단 진단 표준화" 과제는 현재 국내에 진단방법이 적립되어 있지 않은 포충증, 유극악구충증, 톡소포자충증과 개회충증의 고감도 및 표준적인 진단 기준을 확립하는데 그 목적이 있다.
제1세부과제: 포충증의 표준 진단법 확립 및 효능 검증
이 연구는 포충증 환자들의 혈청학적 진단을 위해 표준화된 ELISA 방법을 확립하는 것을 목적으로 한다. 이를 위하여 우즈베키스탄으로부터 자연 감염된 양의 간 또는 폐에서 포충(hydatid cyst)을 분리하여 낭액 (cystic fluid)을 채취하여 실험에 항원으로 사용하였다. 또 우즈베키스탄의 타시켄트 소재 국립응급의료센터에서 진료하는 환자중에서 수술로 확인된 환자의 혈청 21개를 수집하고, 그 외 정상인으로부터 얻은 음성대조군 혈청 39 개를 확보하였다. 교차반응 여부를 관찰하기 위하여 간흡충증 혈청 20개, 폐흡충증 혈청 10개, 스파르가눔 환자의 혈청 10개와 유구낭미충 환자 혈청 8개를 확보하였다. 확보한 항원과 혈청으로 ELISA를 실행하여 Cut-off value는 0.270 으로 정하였으며 민감도는 100%이고 특이도는 95.3%로서 포충증의 혈청학적인 진단 기준을 정립하였다.
제2세부과제: 유극악구충증의 표준 진단법 확립 및 효능 검증
이 연구에서는 악구충증의 진단에 대한 심도 있는 지식체계를 확립하여 환자 발생시 보다 신속하고 정확하게 진단하여 환자 관리를 용이하게 하는데 그 목적이 있다. 악구충증의 혈청학적 진단에 활용하기 위하여 족제비에서 회수한 일본악구충 성충의 수용성 분획(24-80 kDa)과 불용성 분획(35-125 kDa) 단백질을 확보하여 실험에 사용하였다. 또 악구충 감염환자 혈청(n=25), 정상인 혈청(n=7)과 다른 선충류 감염 즉, 선모충증(n=3) 아니사키스증(n=5), 개회충증(n=15) 환자의 혈청을 확보하여 악구충 특이 항원 단백질의 분석을 위하여 면역블럿을 실시하였다. 결과 수용성 분획의 경우 약 60-100 kDa에 존재하는 항원에서 강한 양성 반응이 나타났으며 27-37 kDa의 항원에 대해서도 양성 반응이 나타났다. 그러나 60-100 kDa의 항원은 정상인의 혈청에서도 약한 양성 반응을 나타냈다. 불용성 분획의 면역블럿 결과도 유사하게 나타났는데 약 27-37 kDa에 분포하는 항원에 대해 양성 반응을 나타내었고 약 60-100 kDa에 존재하는 항원에 대해서 강한 양성 반응이 나타났다. 다른 선충류 감염 환자의 혈청을 이용하여 면역 블럿을 실시한 결과 일부 혈청에서 교차반응이 나타났지만 특정 항원에 대한 특이적인 교차반응은 나타나지 않았다. 따라서 의심 환자가 발생하였을 때 유극악구충증 진단에 표준화된 면역혈청학적 방법 구축에 기반을 세웠다.
제3세부과제: 톡소포자충증의 표준 진단법 확립 및 효능 검증
이 연구에서는 기존 교실에서 수행하는 ELSIA 방법과 시판되고 있는 ELISA kit, latex 응집 반응 kit, 최근 개발 중에 있는 SAG 항원 이용 신속진단 킷트의 표준화에서, 각종 kit가 유사한 특이도와 민감도를 보여, 진단 비용, 수행 기술적 난이도 및 전문 기술인의 필요 여부 등으로 장단점을 비교하여 SAG 항원 이용 신속 진단 킷트가 추천되며, SAG 이외에도 높은 항원성을 보이는 GRA2 항원을 발굴하여 민감도를 높일 수 있는 항원으로 활용하고자 한다.
제4세부과제: 개회충증의 표준 진단법 확립 및 효능 검증
이 연구에서는 현재 국내에서 정립되어 있지 않은 개회충증의 진단을 위하여 표준화된 혈청학적 진단법을 확립하는 것을 목적으로 한다. 이를 위하여 본 실험에서는 개회충 2기 유충을 분리하여 조항원을 확보하였고 2기 유충에서 RNA를 뽑아 재조합 단백질 arginine kinase(rTAK)를 발현함으로서 rTAK항원을 확보하여 실험에 항원으로 사용하였다. 또 임상적으로 확인된 개회충증 환자의 혈청 65개를 수집하였고, 그 외 정상인으로부터 얻은 음성대조군 혈청 40개를 확보하였다. 교차반응 여부를 관찰하기 위하여 간흡충증 혈청 12개, 폐흡충증 혈청 8개, 스파르가눔증 혈청 8개, 아니사키스 감염환자 혈청 11개, 유극악구충증 혈청 25, 선모충증 혈청 3개와 유구낭미충증 혈청 8개를 확보하였다. 확보한 혈청과 유충 조항원으로 ELISA를 실행한 결과 민감도 92.3%와 특이도 89.2%로 현재 시판되는 Bordier사의 Toxocara canis ELISA kit와 성적이 비슷하였다. 유충조항원을 이용한 ELISA 진단 기준(Cut-off value)을 0.25로 설정하고 표준화된 진단방법을 구축하였다. 재조합 단백질 rTAK를 항원으로 ELISA를 실행한 결과 민감도는 61.5%이고 특이도는 94.2%로 민감도가 유충조항원을 이용한 것보다 낮아 연구가 더 필요하였다.

Abstract ▼

In this project we want to setup standard sensitive diagnostic method for the specific detection of echinococcosis, gnathostomiasis, toxoplasmosis and toxocariasis in Korea.
The 1st project: Standardization of serodiagnosis for Echinococcosis
As the travelling abroad continuously increases, th

In this project we want to setup standard sensitive diagnostic method for the specific detection of echinococcosis, gnathostomiasis, toxoplasmosis and toxocariasis in Korea.
The 1st project: Standardization of serodiagnosis for Echinococcosis
As the travelling abroad continuously increases, the risk of imported echinococcosis has been increased. The present study was undertaken to develop a serodiagnostic method for echinococcosis and to evaluate its diagnostic efficacy. For setting up ELISA for serodiagnosis of echinococcosis, we collected Echinococcus hydatid cysts from sheep which were naturally infected with E. granulosus in Uzbekistan. The cyst fluid was collected and its supernatant was used as antigen after centrifugation. Also sera of infected patients who were surgically confirmed were collected in a hospital in Uzbekistan. According to the absorbance of 21 echinococcosis positive and 39 negative control sera, cut-off value was determined as 0.27. The sensitivity and specificity of the ELISA assay with hydatid fluid antigen were 100% and 95.3%, respectively. The assay did not cross reacted with the sera of other diseases except cysticercosis. In conclusion, the present ELISA system using hydatid cyst fluid antigen is a sensitive and specific diagnostic tool for echinococcosis.
The 2nd project: Standardization of highly sensitive and advanced diagnostic methods for gnathostomiasis
The present study was undertaken to develop a serodiagnostic method for gnathostomiasis and to evaluate its diagnostic efficacy. For diagnosis of gnathostomiasis, adult worms of Gnathostoma japonicum were collected from Jeju weasels. After homogenization and centrifugation of the worms, the supernatant was used as soluble antigen and pellet was used as insoluble antigen. Sera from 25 gnathostomiasis, 3 trichinelosis, 5 anisakiasis, 15 toxocariasis and 7 from non-infected control were collected for immunoblot assay. The results of immunoblot assay using both soluble and insoluble antigen demonstrated that sera from the patients which reacted between 60 to 100 kDa were strong positive but weak positive between 27 to 37 kDa. There was very few cross reaction with sera with other infected parasitic patients. The negative control sera were found negative. Therefore the immunoblot assay using the antigen collected from adult Gnathostoma could be used for the diagnosis of gnathostomiasis.
The 3rd project: Standardization of highly sensitive and advanced diagnostic methods for toxoplasmosis:
Lab ELISA using crude extracts, ELISA kits for sale, Latex agglutination kit and rapid diagnostic kit (RDT) were compared for the sandardized diagnostic method, which showed relatively similar specificity and sensitivity among the kits tried. Therefore it is recommended that the choice of method depend on the cost of kits, easiness for the procedure, and the necessity of skilled technician. RDT kit using SAG1 is recommended, but more advances in sensitivity by adding GRA2, showed highly antigenic propertiy in this study, is needed for the kit.
The 4th project: Standardization of highly sensitive and advanced diagnostic methods for toxocariasis
Toxocariasis is a worldwide zoonotic disease caused by ascarid nematode Toxocara canis. Diagnosis of human toxocariasis currently relies on serologic tests that use Toxocara excretory-secretory(TES) antigen to detect immunoglobulin G(IgG) antibodies to the larvae by enzyme-link immunosorbent assay(ELISA). This study was undertaken to develop our diagnostic method of toxocariasis by ELISA in Korea and to compare the diagnostic efficacy of the method with the Bordier commercial kit. Toward this goal, we produced soluble crude antigen of T. canis larvae (TLA) and recombinant T. canis arginine kinase(rTAK). Standard ELISA system was developed using TLA and rTAK and compared with commercial kit. Cut-off value was set at absorbance 0.25. The diagnostic sensitivity of human toxocariasis was 92.3% with TLA and 61.5% with rTAK. The specificity was 89.2% with TLA and 94.2% with rTAK. ELISA using TLA is recommended as a standard diagnostic method of human toxocariasis. ELISA using combined antigens of TLA and rTAK may produce better diagnostic values by further studies.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 학술연구용역사업 최종결과 보고서 ... 3
• 목차 ... 4
• 최종결과보고서 요약문 ... 5
• Summary ... 6
• 학술연구용역사업 연구결과 ... 7
• 제1장 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 제2장 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 9
• 제3장 제1세부연구개발과제 최종 연구개발 결과 ... 11
• 제4장 제1세부연구개발과제 연구결과 고찰 및 결론 ... 17
• 제5장 제1세부연구개발과제 연구성과 ... 18
• 제6장 기타 중요변경사항 ... 19
• 제7장 참고문헌 ... 19
• 제8장 첨부서류 ... 20
• 제1장 제2 세부과제 최종 연구개발 목표 ... 22
• 제2장 제 2 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 25
• 제3장 제2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 26
• 제4장 제2 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 36
• 제5장 제2 세부연구개발과제의 연구성과 ... 40
• 제6장 참고문헌 ... 41
• 제7장 첨부서류 ... 43
• 제1장 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 52
• 제2장 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 54
• 제3장 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 결과 ... 56
• 제4장 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 65
• 제5장 제3세부연구개발과제의 연구성과 ... 66
• 제6장 참고문헌 ... 67
• 제7장 첨부서류 ... 67
• 제1장 제4세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 68
• 제2장 제4세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 71
• 제3장 제4세부연구개발과제 최종 연구개발 결과 ... 72
• 제4장 제4세부연구개발과제 연구결과고찰 및 결론 ... 78
• 제5장 제4세부연구개발과제 연구성과 ... 79
• 제6장 기타 중요변경사항 ... 80
• 제7장 참고문헌 ... 80
• 제8장 첨부서류 ... 82
• 해외유입 기생충 표준 진단 방법 ... 84