초록 ▼

이 연구는 신장의 발달 과정과 급성신부전에서 angiopoietins-Tie2 system 발현 양상을 관찰하고 angiopoietins-Tie2 system이 신손상을 예방하거나 치료할 수 있는 가능성이 있는지를 보고자 하여서 다음과 같은 방법을 이용하였음.
1. 신장의 발달단계에서 angiopoietin-1, angiopoietin-2, 그리고 Tie2의 mRNA 및 단백질을 태생기와 태생기후에 관찰.
2. 허혈성 급성신부전을 유발시킨 후 재생하는 신장에서 angiopoietin-1, angiopoietin-2의 발현

이 연구는 신장의 발달 과정과 급성신부전에서 angiopoietins-Tie2 system 발현 양상을 관찰하고 angiopoietins-Tie2 system이 신손상을 예방하거나 치료할 수 있는 가능성이 있는지를 보고자 하여서 다음과 같은 방법을 이용하였음.
1. 신장의 발달단계에서 angiopoietin-1, angiopoietin-2, 그리고 Tie2의 mRNA 및 단백질을 태생기와 태생기후에 관찰.
2. 허혈성 급성신부전을 유발시킨 후 재생하는 신장에서 angiopoietin-1, angiopoietin-2의 발현양상을 In situ hybridization으로 관찰.
3. 사구체 내피세포를 배양한 후 cisplatin을 노출시킨 다음 angiopoietin-1 (200ng/ml)을 같이 투여한 군과 투여하지 않은 군으로 나누어서 배양한 후 apoptosis 정도를 관찰.
4. 이온성 조영제인 sodium-meglumine-ioxithalamate (Telebrix)와 비이온성 조영제인 iopromide (Ultravist)로 나눈 다음 각각의 농도를 정하여 angiopoietin-1 을 같이 투여한 군과 투여하지 않은 군으로 나누어서 배양한 후 apoptosis 정도를 관찰.
5. 여러 가지 inhibitor 를 이용하여 HUVEC에서 Ang-1의 효과가 어떤 signal pathway를 경유하는지 조사했음.
위와 같은 목적으로 실험을 하여 다음과 같은 결과를 얻었음.
백서의 신장 발달 단계에 따른 angiopoietin-1 단백의 발현은 태생기 15일째부터 증가되었다가 태생기 19일이후 지속적으로 발현이 증가되었음. 이런 결과는 angiopoietin-1이 백서의 신장발달에 영향을 미치고 있으며 특히 백서의 태생기 후기부터 태생후 초기 까지 신장의 발달과 연관이 있음을 알 수 있었음. 또한 신장의 발달과정에서의 mRNA 발현양상을 보면 Ang1, Ang2 그리고 Tie2는 태생후 7일과 14일에 가장 많이 증가한 후에 점차 감소하였고 이런 현상은 Ang1과 Tie2가 신장의 발생과정에 밀접한 관련을 가지고 있음을 알 수 있었고 백서의 태아기정상 신장에 대하여 면역조직화학법을 실시하여 위치적으로angiopoietin-1이 사구체에 비하여 신세뇨관에서 높게 발현됨으로 신세뇨관이 백서의 신장발달과 관련이 있음을 알수 있었음.
In situ hybridization을 이용한 ARF 동물 모델에서 Ang1 mRNA는 신장 피질부의 상피세포 (tubular epithelial cells)에서 발현은 거의 없었으나 수질 바깥부위의 상피세포에서 발현이 증가되었음. Ang2 mRNA도 Ang1 mRNA와 비슷하게 신장 수질부의 바깥부위의 상피세포에서 발현을 보임. 이런 결과로 보아Ang-1과 Ang2이 급성신부전후에 수질 바깥부위의 상피세포의 재생에 있어서 관여할 것으로 추정됨.
VEGF (10ng/ml)와 angiopoietin-1 (200ng/ml)은 bovine glomerular endothelial cell 에서 serumfree에 대한 apoptosis 억제 효과가 있었음을 확인할 수 있었음.
human glomerular endothelial cell 을 2%FBS 상태에서 50 시간 incubation시킨 상태를 control로 하고 cisplatin 2, 000ng/ml 으로 처리하였을 때 apoptosis가 증가하였는데 angiopoietin-1 (200ng/ml)을 cisplatin2, 000ng/ml 과 같이 처리하면 apoptosis가 감소하였다. 이런 결과로 angiopoietin-1이 human glomerular endothelial cell 에서 cisplatin에 의해서 유발된 apoptosis에 anti-apoptotic effect가 있음을 알 수 있었음.
human glomerular endothelial cell 을 2%FBS 상태에서 24 시간 incubation시킨 상태를 control로 하고 조영제를 이온성 조영제인 sodium-meglumine-ioxithalamate (Telebrix)와 비이온성 조영제인 iopromide (Ultravist)로 나눈 다음 각각의 농도별로 약 60분간 노출시킨 후 24시간 후에 apoptosis가 일어난 정도를 확인한 결과 100mgI/ml, 에서 이온성 조영제가 비이온성 조영제보다 apoptosis가 월등하게 많이 일어났음을 확인하였고 이런 결과는 조영제에 의한 혈관 내피 세포에 손상을 일으키는 기전이 apoptosis에 의한 것임을 알 수 있었음. 또한 비이온성 조영제(iopromide) 300mgI/ml 으로 약 60분간 노출시킨 다음 angiopoietin-1 (200ng/ml)으로 처리한 군과 처리하지 하지 않은 군으로 나누어서 24시간 후에 apoptosis를 확인한 결과 angiopoietin-1을 처리한 군에서 angiopoietin-1을 처리하지 않은 군보다 apoptosis가 감소 된 것을 확인할 있었음. 이런 결과로 angiopoietin-1이 조영제에 의하여 발생한 apoptosis를 억제하는 효과를 가짐을 확인할 수 있었음.
Huvec에서 control, 5, 10, 15, 30분의 time course로 Ang-1(200ng/ml)을 처리하여 Phospho-Akt의 phosphorylation을 관찰하였을 때, Akt의 phosphorylation이 time-dependent하게 증가하였으며 15분에서 최대로 증가하였음. PI3-kinase/Akt의 inhibitor인 wortmannin을 처리하였을 때 Akt의 phosphorylation이 억제되었음. Akt의 downstream pathway인 p70s6k phosphorylation 또한 Ang-1에 의하여 time-dependent하게 증가하였으며, mTOR의 blocker인 rapamycin을 사용하였을 때 p70s6k phosphorylation이 감소하였음. 이런 결과로 보아 HUVEC에서의 Ang-1의 효과가 PI3-kinase/Akt, p70S6K pathway를 경유해서 나타나는 것으로 보임.
이상의 연구를 수행하여 angiopoietins-Tie2 system이 신장 발달 과정에서 발현 양상을 관찰하였고 허혈성 신손상시 angiopoietins-Tie2 system을 이용하여 신장 재생을 촉진시킬 수 있는 새로운 방법을 개발할 수 있는 가능성을 제시하였음. 또한 실제적으로 많이 사용하고 있는 cisplatin과 상기 조영제에 대한 부작용을 예방하거나 줄일 수 있는 치료법을 개발할 실마리를 제공하였음

Abstract ▼

This study was aimed to investigate the expression of angiopoietins-Tie2 system in renal development and experimental model of acute renal failure and test the possibility to use angiopoietins-Tie2 system in preventing renal injury in glomerular diseases
1. Examine mRNA and protein levels of angi

This study was aimed to investigate the expression of angiopoietins-Tie2 system in renal development and experimental model of acute renal failure and test the possibility to use angiopoietins-Tie2 system in preventing renal injury in glomerular diseases
1. Examine mRNA and protein levels of angiopoietin-1, angiopoietin-2, and Tie2 in various fetal and postnatal stages.
2. Examine the expression of angiopoietin-1, angiopoietin-2 in regenerating kidneys after induction of acute postischemic renal failure by In situ hybridization.
3. Examine the effect of angiopoietin-1 (200ng/ml) on degree of apoptosis after exposure of cisplatin (2,000 ng/ml) in cultured glomerular endothelial cells.
4. Examine the effect of angiopoietin-1 (200ng/ml) on degree of apoptosis after exposure of ionizing contrast agent, sodium-meglumine-ioxithalamate (Telebrix) and non-ionizing contrast agent, iopromide (Ultravist) in cultured glomerular endothelial cells.
5. Examine the signal pathway of effect of angiopoietin-1 on apoptosis by various inhibitors in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).
The following results were obtained.
Protein levels of angiopoietin-1 were high in kidneys during fetal development. These results indicate that the angiopoietin system is actively involved in the nephrogenesis during the fetal period and during the early postnatal period.
mRNA levels of angiopoietin-1, 2 and Tie2 were high in kidneys during 7 and 14 days after birth and decreased thereafter. These resul ts indicate that the angiopoietin-Tie2 system is actively involved in the early postnatal period.
Immunohistochemistry study of the normal fetal kidneys revealed that the expression of angiopoietin-1 in tubules is higher than that of glomeruli suggesting the association of angiopoietin-1 in renal development.
In situ hybridization in experimental model of acute renal failure revealed little Ang1 mRNA expression in tubular epithelial cells but increased expression in epithelial celles in renal outer medulla. Ang2 mRNA showed similar expression.
These results suggest that Ang-1 and Ang2 may be involved in epithelial regeneration in experimental model of acute renal failure.
VEGF (10ng/ml) and angiopoietin-1 (200ng/ml) showed anti -apoptotic effect about serum free state in bovine glomerular endothelial cells.
Angiopoietin-1 also showed anti-apoptotic effect about cisplatin induced apoptosis in bovine glomerular endothelial cells.
The degree of apoptosis after exposure of ionizing contrast agent, sodium-meglumine-ioxithalamate (Telebrix) was more severe that that of non-ionizing contrast agent, iopromide (Ultravist) in cultured glomerular endothelial cells.
Angiopoietin-1 also showed anti-apoptotic effect about contrast agent induced apoptosis in human glomerular endothelial cells.
In HUVEC, the anti-apoptotic effeect of Ang-1 seems to be mediated by PI3-kinase/Akt, p70S6K pathway.
These findings suggest that angiopoietins-Tie2 system angiopoietin-Tie2 system is actively involved in the early postnatal period and in epithelial regeneration in experimental model of acute renal failure. This study can ignite the strategy improving renal regeneration after ischemic renal injury by modulating angiopoietins-Tie2 system. This study also can provide some clues in the prevention and mitigation of acute renal failure induced by various nephrotoxic agents.

목차 Contents

• 표지 ... 2
• 제출문 ... 4
• 목차 ... 5
• I. 연구개발결과 요약문 ... 6
• (한글요약문) ... 6
• (영문요약문) ... 8
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 11
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 11
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 14
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 21
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 23
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 26
• 6. 참고문헌 ... 27