초록 ▼

레트로바이러스의 일종인 Lentiviru s는 현재 유전자 전달 벡터로 광범위하게 쓰이고 있지는 않으나 일반적인 레트로바이러스와는 달리 분열하는 세포 뿐 아니라 성장이 멈춘 세포나 분화가 끝난 세포에도 감염할 수 있다는 특성 때문에 유전성 및 퇴행성 질환을 대상으로 한 유전자전달 벡터로 개발되고 있다. 가장 먼저 개발된 렌티바이러스벡터는 HIV- 1(human immun odeficiency virus type 1)을 변형시킨 벡터시스템으로 일부 acces sary gene을 제거한 HIV 벡터의 경우 VSV envelope 단백질

레트로바이러스의 일종인 Lentiviru s는 현재 유전자 전달 벡터로 광범위하게 쓰이고 있지는 않으나 일반적인 레트로바이러스와는 달리 분열하는 세포 뿐 아니라 성장이 멈춘 세포나 분화가 끝난 세포에도 감염할 수 있다는 특성 때문에 유전성 및 퇴행성 질환을 대상으로 한 유전자전달 벡터로 개발되고 있다. 가장 먼저 개발된 렌티바이러스벡터는 HIV- 1(human immun odeficiency virus type 1)을 변형시킨 벡터시스템으로 일부 acces sary gene을 제거한 HIV 벡터의 경우 VSV envelope 단백질로 pseudotyping되었을 때 동물시험에서 뇌, 간, 근육 세포 등 광범위한 세포로 감염할 수 있고, 6개월 이상 지속적인 유전자 발현을 유도할 수 있음이 보고된바 있다. 그러나 HIV 벡터의 잠재적인 위험 때문에 아직 인체를 대상으로 한 임상시험은 시도되고 있지 못한 실정이다. 따라서 현재 국외의 많은 연구자들이 보다 안전한 렌티바이러스 벡터시스템을 개발하기 위하여 SIV (simian immunodeficiency virus) 및 non-primate lentivirus (BIV, FIV, EIAV)들을 사용한 벡터시스템들의 개발을 추진하고 있으며, EIAV 벡터시스템의 경우 영국과 일본에서 특허권을 확보하여 차세대 유전자치료 시장의 선점을 꾀하고 있다. 이에 본 연구진은 안전성과 간편성이 향상된 새로운 렌티바이러스 벡터시스템을 개발하여 독자적인 산업재산권을 확보하고 뇌신경 질환과 같은 난치성 질환 유전자치료 분야의 국가경쟁력을 제고하기 위해 CAEV 벡터시스템을 개발하고자 하였다.
MCMV promoter/ globin intron 발현벡터시스템을 이용하여 CAEV gag-pol 유전자와 RRE 염기서열을 포함한 rev 유전자를 발현하는 pMG/CAEV-GagPol 벡터를 제조하였다. 또한 U3region이 MCMV promoter로 대치되고 lacZ 유전자를 internal promoter (MCMV promoter)로부터 발현하는 CAEV transfer 벡터를 제조하였다. 이 두 벡터 DNA와 다양한 프로모터로부터 발현이 비교되어 가장 높은 발현효율을 보이는 VSV-G 발현벡터를 293T 세포에 형질도입 시킨 뒤, 재조합 렌티바이러스가 포함된 세포배양액을 이용하여 인체세포주에 감염시키고 X-gal 염색을 통해 바이러스 감염여부를 확인한 결과 본 과제에서 제조한 CAEV 렌티바이러스 벡터시스템을 이용하여 인체세포에 유전자를 전달할 수 있다는 사실을 확인하였다. 본 연구팀은 이 벡터시스템의 효율성을 향상시키기 위해 전사패턴과 벡터의 염기서열을 분석하여 적용하는 연구를 수행 중이다.

Abstract ▼

Retroviruses have received considerable attention as gene transfer vectors because they efficiently integrate their genome into host chromosomal DNA and offer the potential for long-term expression. However, MuLV-based retroviral vector can not transduce non-dividing cells. Lentivirus-based vectors

Retroviruses have received considerable attention as gene transfer vectors because they efficiently integrate their genome into host chromosomal DNA and offer the potential for long-term expression. However, MuLV-based retroviral vector can not transduce non-dividing cells. Lentivirus-based vectors have the ability to infect and integrate viral DNA into nondividing cells and thus overcome the major limitation of MuLV-based retroviral vectors. Recent studies have shown the utility of VSV-G pseudotyped HIV vectors to transduce nondividing neurons and other cell types by direct injection in vivo.
An alternative lentivirus-based approach would be to develop vectors from lentiviruses nonpathogenic for humans. Several recent reports describe the construction of vectors based upon FIV, EIAN, and BIV.
In this study, we explored the feasibility of using lintiviral vectors based on CAEV.
The normal host range of CAEV includes goats. Three is no reportd case of human infection by CAEV. However, several features of CAEV biology make this virus an attractive virus to develop as a gene therapy vector. Like other lentiviruses, CAEV is capable of infecting mature macrophages, neurons, and condrocytes, and thus, has the potential to infect quiescent cells. The pMG/CAEV-GagPol plasmid was designed to express CAEV proteins required for assembly and release of viral particles from cells and in cludes encoding proteins from the gas and pol genes as well as genes encoding the regulatory protein Rev. The pCAM/lacZ plasmid was designed to serve as the vector for gene transfer and contains all cis-acting sequence elments required to support reverse trnascripiton and integration of the vector genome and a reporter lacZ gene. Sequences containing the poorly defined CAEV RRE were not included. Since the CAEV transcripional enhancer/promoter functions poorly in human cells, the MCMV enhancer/promoter was substitutd for the U3 domain of the 5' LTR. Replication defective CAEV vectors have been produced that encode E.coli beta-galactosidase. Theses vectors were able to act as vehicles to carry genes into cultured human cells. This properties make CAEV vectors promising gene transfer vehicles.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 6
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 7
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 8
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 27
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 29
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 30
• 6. 첨부서류 ... 31
• 세부연구개발과제 연구결과 ... 32
• 1. 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 33
• 2. 세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 33
• 3. 세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 35
• 4. 세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 54
• 5. 세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 56
• 6. 세부연구개발과제의 활용계획 ... 57
• 7. 참고문헌 ... 58
• 최종보고서 비공개 승인요청서 ... 62