초록 ▼

사람의 호흡상피세포 중 비강점막세포를 Transwell에 단층으로 배양하여 약물의 투과성을 in vitro 상에서 간편하고 신속하게 평가하는 system을 구축하고 이를 이용하여 각종 스테로이드성 약물의 투과도를 측정하고 mucin 분비 등의 약리학적인 활성의 변화를 관찰하고자 하는 것이 본 연구의 목적이다. 사람의 비강의 점막상피세포를 단층막으로 배양한 후 SEM, TEM을 통하여 육안으로 형태를 관찰하였고 TEER값을 측정하여 tight junction의 발현을 계량적으로 표시하였다. 모델 약물로서 mannitol과 budeso

사람의 호흡상피세포 중 비강점막세포를 Transwell에 단층으로 배양하여 약물의 투과성을 in vitro 상에서 간편하고 신속하게 평가하는 system을 구축하고 이를 이용하여 각종 스테로이드성 약물의 투과도를 측정하고 mucin 분비 등의 약리학적인 활성의 변화를 관찰하고자 하는 것이 본 연구의 목적이다. 사람의 비강의 점막상피세포를 단층막으로 배양한 후 SEM, TEM을 통하여 육안으로 형태를 관찰하였고 TEER값을 측정하여 tight junction의 발현을 계량적으로 표시하였다. 모델 약물로서 mannitol과 budesonide를 선정하여 단층막을 통한 투과도를 관찰하였다. 사람의 비강점막상피세포를 계대배양하여 단층막을 형성시키고 이를 이용하여 약물의 투과실험을 in vitro에서 신속하게 수행할 수 있는 시스템을 성공적으로 확립하였다. LCC법으로 계대배양할 경우 passage 4까지 tight junction의 형성이 잘 이루어지는 것을 SEM, TEM, Actin staining을 통하여 육안으로 확인하였으며, TEER값을 측정함으로서 손쉽게 그 정도를 정량적으로 확인할 수 있었다. 또한 대표적인 수용성 및 지용성 약물로서 mannitol과 budesonide를 선택하여 단층막을 통한 투과의 정도를 관찰한 결과, budesonide의 경우는 TEER값의 영향을 덜 받았으나 mannitol의 경우는 TEER값이 500 ohm 까지는 급격한 감소를 나타내다가 이후에는 TEER값에 관계없이 거의 일정한 값을 나타내었다. 또한, 다양한 지용성을 가진 스테로이성 약물을 선정하여 투과도를 측정한 결과, 약물의 지용성에 비례하여 투과도가 log linear하게 증가하는 것을 관찰하였다. 그러나, LCC법으로 배양한 경우는 tight junction의 형성이 신속하다는 장점은 있지만 섬모와 mucin의 분비가 불완전하여 in vivo 조건을 완벽하게 재현하지 못하다는 단점이 있었다. 따라서, 이러한 단점을 보완하기 위하여 apical쪽의 배지를 제거하여 배양하는 ALI법을 사용하였으며 섬모 및 mucin gene의 발현이 LCC보다 뛰어난 것을 확인하였다. 또한 mannitol과 budesonide의 투과도를 관찰한 결과, budesonide의 투과도가 약간 감소하는 것을 알 수 있었는데 이는 ALI법에 의해 발현된 섬모와 mucin의 영향인 것으로 생각된다.

Abstract ▼

The purpose of this study was to evaluate the feasibility of using a serially passaged culture method of an nasal epithelial cell monolayers on a permeable support for in vitro drug transport studies. The optimum conditions for passaged culture as well as the correlation between the trans-epithelial

The purpose of this study was to evaluate the feasibility of using a serially passaged culture method of an nasal epithelial cell monolayers on a permeable support for in vitro drug transport studies. The optimum conditions for passaged culture as well as the correlation between the trans-epithelial electrical resistance (TEER) value and drug permeability (Papp) were evaluated. Fresh human nasal epithelial cells were collected from the normal inferior turbinates, and were subcultured repeatedly in serum-free bronchial epithelial cell growth media (BEGM) in petri dishes. The subcultured cells of each passage were seeded onto permeable supports at cells/, and grown in Dulbeccos modified eagle media (DMEM). Morphological characteristics were observed by scanning electron microscopy (SEM). To verify the formation of tight junctions, actin staining and transmission electron microscopy (TEM) studies were conducted. In the drug transport study, 14C-mannitol and budesonide were selected as the paracellular and the transcellular route markers, respectively. Serially passaged cells were successfully cultured on a permeable support and showed significantly high TEER values up to passage-4. After 14 days of seeding, SEM showed microvili while protrusions of cilia and mucin granules were detected by TEM. The paracellular marker 14C-mannitol showed a nearly constant permeability coefficient (Papp) when the TEER value exceeded 500 ohms regardless of the passage number. However, as expected, budesonide showed a higher permeability coefficient compared to -mannitol, and was less affected by the TEER value. Human nasal epithelial cell monolayers were successfully subcultured on a permeable support up to passage-4. These cell culture methods may be useful in high-throughput screening of in vitro nasal transport studies of various drugs.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• I. 연구개발결과 요약문 ... 5
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summary ... 6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 7
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 11
• 1) 비강점막상피세포의 분리 및 배양 ... 11
• 2) Transwell에서의 배양 ... 11
• 3) TEER의 측정 ... 12
• 4) Budesonide 및 14C-mannitol의 투과 실험 ... 12
• 5) Transmission Electron Microscopy (TEM) ... 13
• 6) Scanning Electron Microscopy (SEM) ... 15
• 7) Actin Staining ... 15
• 8) Inserts의 영향 ... 16
• 9) TEER의 변화 ... 17
• 10) TEER와 14C-mannitol permeability와의 상관관계 ... 18
• 11) budesonide의 투과실험 ... 18
• 12) 다양한 스테로이드성 약물의 투과실험 ... 20
• 13) ALI의 영향 ... 23
• 14) 참고문헌 ... 28
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 30
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 31
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 32
• 6. 첨부서류 ... 33