$mM^{-1}s^{-1}$
고수율 만니톨 균주의 개량을 위해 만니톨 생산의 핵심효소인 NAD(P)H dependent mannitol dehydrogenase (MDH) 유전자를 클로닝하였다. 이를 위하여 생산균주인 C. magnoliae로부터 MDH 효소를 다양한 크로마토그래피를 통해 정제하여 142 kDa의 분자량을 갖는 tetramer로서 기존에 알려진 효소에 비해 매우 높은 기질 특이성과 catalytic efficiency ($k_{cat}$/$K_{m}$ = 29.4 $mM^{-1}s^{-1}$)를 갖는 효소임을 확인하였다. C. magnoliae MDH의 부분적 amino acid 서열은 다양한 미생물 유래의 short chain dehydrogenase/reductase (SDR)과 높은 유사성을 보였으며, sequential ordered Bi Bi 반응 기작을 나타내었다. 정제된 효소의 N-말단과 내부의 아미노산 서열로부터 탐침자를 합성하고 PCR을 통하여 총 852개의 염기서열을 확인하였다. 이를 대장균에서 발현하여 그 활성을 확인한 후, 만니톨 고생산성 모균주의 유전체에 Liacetate 법을 사용하여 삽입함으로써 기존 균주보다 높은 생산성과 과당 대비 만니톨 수율을 갖는 재조합 균주를 확보하였다. 확보된 재조합 균주를 이용한 최적 발효 조건을 확인한 결과, 산업용 단순 발효 배지는 플라스크에서 포도당 80g/L, 과당 150g/L, $(NH_{4})_{2}SO_{4}$ 2.5g/L, urea 1.2g/L, $KH_{2}PO_{4}$ 2.5g/L, $MgSO_{4}$ 2.5g/L, NaCl 0.1g/L, trace elements (biotin, pyridoxine, thiamine, $CaCl_{2}$, $CuSO_{4}$, $FeSO_{4}$, $ZnSO_{4}$ , $MnSO_{4}$), 최적 pH는 5.0, 최적 발효 온도는 34℃로 결정되었다. 5L jar에서 수행된 유가식 배양에서는 상기의 배지 조건에서 과당이 제외된 배지에서 균주의 생장을 유도한 후 총 공급 과당의 농도를 270g/L로 하여 발효를 수행하였다. 이와 같은 유가식 배양방법에 의해 270g/L의 과당으로부터 78시간 만에 243.1g/L의 만니톨을 생산하였으며 과당에 대한 만니톨의 수율 90.9%와 만니톨의 생산성 3.12g/L-h로 결정되었다. 아울러 부산물인 EtOH이 MDH 효소의 저해제임을 확인하고, alcohol dehydrogenase가 knock-out 된 균주를 제조하여, 부산물인 EtOH을 30% 수준으로 감소시켰다. 재조합 균주와 새로운 배지 조성으로 생산된 만니톨의 정제를 위하여 배양 상정액을 강산성 양이온수지, 약염기성 음이온 수지, 강염기성 음이온 수지 순으로 통과시켜 정제 수율은 93%, 순도는 99% 이상으로 만니톨을 회수하였다. Candida 세포를 파쇄한 후 얻어진 세포 추출액을 침전, UF, DEAE-cellulose 크로마토그래피를 통해 부분 정제한 후 얻어진 MDH 효소를 고정화 한 결과, Ca-alginate에서 과당대비 전환 수율이 56%로 가장 좋은 결과를 나타내었다. 또한 500L scale에서도 실험실 조건과 유사한 과당대비 만니톨 전환수율 87%, 3.05g/L-h의 생산성, 최종 만니톨 농도 234.6g/L를 확인하였으며, 정제과정까지 수행하여 시제품을 생산하였다.
Abstract
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Mannitol biosynthesis in Candida magnoliae is catalyzed by mannitol dehydrogenase (MDH), an enzyme that converts fructose to mannitol. NAD(P)H-dependent MDH was purified to homogeneity from C. magnoliae by ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and affinity chromatograp
Mannitol biosynthesis in Candida magnoliae is catalyzed by mannitol dehydrogenase (MDH), an enzyme that converts fructose to mannitol. NAD(P)H-dependent MDH was purified to homogeneity from C. magnoliae by ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and affinity chromatography. The relative molecular weights of C. magnoliae MDH as determined by SDS-PAGE and size exclusion chromatography was 35 and 142 kDa, respectively, indicating that the enzyme is a tetramer. C. magnoliae MDH showed high substrate specificity and high catalytic efficiency (kcat/Km = 29.4 mM1 s1) for fructose, which may explain the high mannitol production observed in this strain. Initial velocity and product inhibition studies suggest that the reaction proceeds via a sequential ordered Bi Bi mechanism, which is typical of a short-chain dehydrogenase/ reductase (SDR). The mdh gene encoding an open reading frame of 852 bp was subsequently isolated using N-terminal or internal amino acid sequences and RACE, and transformed into C. magnoliae. Optimization for mannitol production was performed. The optimized fermentation medium contained 80g/L glucose, $(NH_{4})_{2}SO_{4}$ 2.5g/L, urea. 2g/L, $KH_{2}PO_{4}$ 2.5g/L, $MgSO_{4}$ 2.5g/L, NaCl 0.1g/L, and trace elements. Fermentation was performed at 30℃, the pH of the culture broth was maintained at 5.0 during fermentation. The carbon source, a solution of fructose was fed intermittently. In fed-batch culture, the volumetric production rate and mannitol yield from fructose were maximum at a controlled fructose concentration of about 50 g/L. Under these conditions, a final mannitol production of 243.1g/L, which corresponded to a yield of 90.9%, was obtained from 270 g/L fructose in 78 hrs. And the scale-up experiment for commercial mannitol production was performed in 500L pilot fermentor to give a final mannitol production of 234.6g/L, corresponding to a yield of 87 %, and a productivity of 3.05g/L-h. Ca-alginate was chosen as a matrix for the immobilization of enzyme, and the immobilized MDH showed a conversion yield of 56%. We developed the purification process for mannitol with a recovery yield of 93%, and the purified mannitol had a purity of 99%.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- 목차 ... 4
- 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
- Project Summery ... 6
- 총괄연구개발과제 연구결과 ... 7
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 12
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 39
- 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 41
- 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 44
- 6. 첨부서류 ... 45
- 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 46
- 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 47
- 2. 연구의 내용 및 방법 ... 50
- 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 51
- 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 67
- 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 69
- 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 70
- 7. 참고문헌 ... 70
- 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 72
- 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 73
- 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 76
- 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 77
- 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 92
- 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 94
- 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획 ... 95
- 7. 참고문헌 ... 95
- 최종보고서 비공개 승인요청서 ... 97
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