초록 ▼

(1)연구배경 및 필요성
근위축성축삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis)는 10만명중 5명의 비율로 많은 사람들이 이병으로 고통받고 있고, 한 가족이 매년 20만불의 의료비용을

감수해야하는 만성 퇴행성 신경계질환의 하나이다. 주로 lower motor neuron에 서 시작하여 점차 upper motor neuron의 손상으로 진행되며, 대뇌피질, 뇌간,

척수의 운동신경세포의 손상을 동반하고, 근위축, 호흡근력약화 및 섬유소성 연축이 서서히 진행되어 처음 관찰된지 2-5년안

(1)연구배경 및 필요성
근위축성축삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis)는 10만명중 5명의 비율로 많은 사람들이 이병으로 고통받고 있고, 한 가족이 매년 20만불의 의료비용을

감수해야하는 만성 퇴행성 신경계질환의 하나이다. 주로 lower motor neuron에 서 시작하여 점차 upper motor neuron의 손상으로 진행되며, 대뇌피질, 뇌간,

척수의 운동신경세포의 손상을 동반하고, 근위축, 호흡근력약화 및 섬유소성 연축이 서서히 진행되어 처음 관찰된지 2-5년안에 사망할확율이 매우높은 무

서운 질병이다. riluzole은 세계적으로 FDA의 허가를 받은 유일한 예방치료약물로서, glutatamate release를 억제하고, 항산화작용을 갖는 물질이다. (주)뉴로

테크는 anti-excitotoxicity 작용 및 강력한 antioxidant작용등 multiple neuroprotection 기능을 갖는 Neu2000을 개발하였는데, 본 연구에서는 ALS model mice

에 대한 효과를 riluzole의 효과와 비교하여 신약으로서의 가능성을 검토하였다.
(2) 실험방법
1) 실험동물 및 약물투여 ALS model mice로서 human CU,ZnSOD1(G93A)Gurl mice암컷(Tg(+))을 Jaxon laboratory에서 구입 또는 자체 breeding하여사용하

였다 (Gurney et al., 1994). 음성대조군으로는 nontransgenic Tg(-) littermate를 사용하였고, background mice로서는 B6SJLF1/J mice를 사용하였다. Mice들

에게 8주령부터 매일 약 Neu2000 10 mg/kg/day, 또는 Neu2000 30 mg/kg/day을 식수를 통하여 자유로 섭취케 하였다. 대조약물로서 riluzole은 자체합성

하여 20 mg/kg/day가 되도록 식수를 통하여 자유로 섭취케하였다. 식수량의 변화 및 체중변화는 주간격으로 측정하였다.
2) mice의 생존 판정기준: mice가 옆쪽에서 압력을 가하였을 때 쓰러져 30초이상 일어나지 못할 때 사망으로 간주하였다.
3) 행동약리실험:
각 mice들에 대하여 매주 또는 특정 주령에, extension reflex test (mice를 거꾸로 현수하였을때 뒷다리 양쪽의 신전이 모두 성공적이면 2점, 한쪽뒤다리만

성공적인 신전을 보이면 1 점, 두 뒷발 모두 신전이 없으면 0점으로 cunting하였다), grip strength test (Digital force guage DFIS10로 앞발의 악력을 g force

로 측정하였다), rotarod test (16 rpm으로 회전하는 회전봉위에서, mice를 올려놓고 견디는 시간을 초단위로 counting하였다. 3회실시하여 최대치를 사용하

였으며, 120초이상 견디는 것을 합격점의 cutoff로 하였다.) Stride length test (120일령에 mice의 뒷받과 앞발에 서로다른 물감을 칠하여 5 cm X 90 cm의

백지위를 걷게한뒤 그 뒷발의 평균보폭을 mm단위로 측정하였다)
3) 생존 운동신경세포의 counting: 약물등이 투여된 각군의 mice를 120일령째에 심장을 통한 PBS관류 및 paraformaldehyde solution관류와 연이은 sucrose

down과정을 거쳐 -80도에 보관시켜두었턴 spinal cord preparation의 lumbar 2-3 segment에 대하여 Cresyl violet staining (Nissle staining)을 행하여 생존한

ventral large motor neuron을 conting하였다. 일부 eosinopfilic cell counting을 위하여는 H&E staining을 이용하였다.
4) mitocondrial ROS의 측정: Mitotracker Red CMH2XRos (0.2 nmol)을 mIce의 뇌실내 투여하고 24시간후 PBS perfusion과 paraformaldehyde solution에 의

한 고정뒤 motor neuron의 mitochondrial ROS를 형광현미경으로 측정하였다.
5) 3-nitrotyrosine staining: 1차 항체로서 3-nitotyrosine Ab (UBI, 1:400), 2nd Ab로서 FITC-rabbit IgG (Chemicon, 1:200)을 사용하였다. Microglial staining:

1차항체로서 OX-42 Ab (Serotec, 1:200), 2nd Ab로서 FITC-mouse IgG (Chemicon 1:200)을 사용하였다.
(3) 실험결과
1) Vehicle 투여군은 평균 131.23.64일(n=12)생존하였

고, Neu200 30 mg/kg/day투여군은 ALS model mice의 생존을 유의적(p<0.005; 143.5
src="http://plasma.kisti.re.kr/cgi-bin/mimetex.cgi?{\pm}">2.93일, n=11)으로 연장하였으며, 그 효과는 Riluzole 20 mg/kg/day투여군의 효과 (137.1
border=0 alt={\pm} align=absMiddle src="http://plasma.kisti.re.kr/cgi-bin/mimetex.cgi?{\pm}">3.72일, n=12)보다 우수하였다. Neu2000의 효과는 10

mg/kg/day(138.42.5일, n=12) 및 30 mg/kg/day투여

군에서 각기 용량 의존적이었다.
2) Neu2000은 cresyl violet (+) 운동신경의 생존을 연장하는 경향을 보인다.
3) Neu2000은 척추의 eosinophilic dying cell의 수를 감소시키는 경향을 보인다.
4) Neu2000은 ALS mice의 extension reflex, rotarod상의 motor-coordination performaces, stride length등의 신경약리적 퇴행과정의 진행을 일부 지연하는 경

향을 나타낸다.
5) Neu2000은 ALS mice의 앞발의 grip strength능력에는 큰 변화를 미치지 않는다.
6) Neu2000은 ALS mice의 spinal motor neuron의 mitochondrial ROS, nitrotyrosine-positive staining, microglia staining, COX-2 staining에서는 일부 section

에서 약간의 억제 경향을 보였다.
7) Neu2000은 10, 30 mg/kg/day의 Tg(-)에 94일간 음수로 투여시 혈액, 장기상 특별한 병변을 볼수 없었다.
(4)고찰 및 결론
Neu2000은 그 강력한 항산화작용 (hydroxyl radoical scavenging action등), 향 흥분성독성작용등에 의하여 ALS model mice의 산화적stresss에 의한 질병악

화과정등을 억제하여, 행동 약리적 증상완화와 생존운동신경세포수의 증가등을 가져오며, 궁극적으로 ALS mice의 생존을 10%정도증가시킨 것으로 보인다

. 기존 riluzole의 효과 또한 7-10%의 생존 연장 효과가 보고 된바 있으나 본실험에서 우리가 직접 동일조건에서 비교한 결과로는 Neu2000이 riluzole보다

다소 우수한 것으로 나타났다. 더구나 riluzole을 mice에 경구단회투여시 급성독성 (LD50)이 85 mg/kg인 것에 비하여, Neu2000의 단회경구투여에 의한 급성독성(LD50)은 1780mg/kg에 불과하므로 therapeutic ratio상의 상대적인 안정성면에서도 우수한 것으로 판단된다. 장차 2004년말에는 뇌졸중실험을 위한 Neu2000의 전임상 실험이 완료되므로, 이후 국내의 ALS환자에 대하여 drinking water를 통하여 neu2000의 효과를 컴토할 예정이다. Neu2000의 보다 구체적인 작용기전에 관하여는 향후 추가적 검토가 이루어질 예정이다.

Abstract ▼

(1) Background of this study:
Amyotrophic lateral sclerosis is a fatal neurodegenerative diseases occuring 5 persons per 100, 000 people since about 50 % of ALS patients usually die 3-4 years after the diagosis. Riluzole is an only clinically available drug approved by FDA of which mechanisms are

(1) Background of this study:
Amyotrophic lateral sclerosis is a fatal neurodegenerative diseases occuring 5 persons per 100, 000 people since about 50 % of ALS patients usually die 3-4 years after the diagosis. Riluzole is an only clinically available drug approved by FDA of which mechanisms are based upon anti-glutamate release inhibitory and antioxidant actions. Neurotech Pharmaceuticals recently developed a new compound, Neu2000 with potent antioxidant and anti-glutamate toxicity action. In this experiments we compared the effects of Neu2000 and riluzole using ALS model mice.
(2) Experimental methods and results
As an ALS model mouse, we used hCu,ZnSODl(G93A)Gur mice and drugs were treated to the mice through drinking water from 8 week-old to the death or 120 day-old.
1) Neu2000 30 mg/kg/day group (143.52.93 days) significantly(p<0.05) expanded life spans of ALS model compared with the vehicle-treated ALS mice (131.2.3.64 days). Neu2000 10 mg/kg/day group (138.4 2.5 days) still showed life span-prolonging tendency. Riluzole 20 mg/kg/day (137.13.72 days) expanded life spans of ALS mice but the effect is relatively weaker than Neu2000.
2) Neu2000 10 or 30 mg/kg/day-treatment showed protective tendency against the death of somatic motor neurons of ALS mice.
3) Neu2000 10 mg/kg/day group showed the tendency of decrease of the eosinophilic dying cells in the lumbar pinal cord.
4) Neu2000 showed tendency of delaying neurobehavioral degeneration measured by extension reflex test, rotarod test, and stride length test.
5) Neu2000 showed tendency of decreases of mitochondrial ROS accumulation, nitotyrosine positive-staining intensity, COX-2 staining intensity, microglial staining intensity in several sections.
6) Neu2000 10 or 30 mg/kg/day treatment to littermate Tg(-) control mice for 94 days did not show any toxicological abnormalities.
(3) Discussion and Conclusion
Neu2000 expanded life spans of ALS model mice upto 10% mainly by its strong antioxidant action and possibly by antiexcitotoxicity action. The effect of Neu2000 is superior to riluzole in terms of efficacy and therapeutic ratio. Oral acute toxicity of rihizole (LD50) is 85 mg/kg in mice. However, the LD50 of Neu2000 is 1780 mg/kg in mice. We are planning to enter into clinicla study at the end of 2004 year and the success of Neu2000 in the prevention and cure of ALS patients will warrant tremendous sales not only in the domestic market but also foreign markets in the near future.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• I. 연구개발결과 요약문 ... 5
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summary ... 6
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 7
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 18
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 31
• 참고문헌 ... 33
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 33
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 34
• 6. 첨부서류 ... 36
• III. 제1세부연구개발과제 연구결과:근위축성 측상경화증의 예방 및 치료제의 개발 ... 39
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 40
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 40
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 40
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 40
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 41
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획 ... 42
• 7. 참고문헌 ... 42