초록 ▼

● 연구목적
다양한 신호전달물질을 농축하고 있는 분획화된 원형질막 구조체인 Caveolae는 세포분열, 분화, 사멸, 노화 등 다양한 세포학적 현상의 조절에 핵심적인 기능을 하고 있다. Caveolae를 구성하는 Caveolin이 폐암 등에서는 종양억제유전자로, 전립선암 등에서는 발암유전자로 기능한다는 발견등에 기초하여 Caveolin 종양관련기능의 상반성, 조직특이성 및 종양악성화과정에서의 기능의 반전가능성을 분석하고자 한다. Caveolae와 종양증식, 사멸, 침윤, 전이 등과의 관련성이 지속적으로 제기된 반면 Caveol

● 연구목적
다양한 신호전달물질을 농축하고 있는 분획화된 원형질막 구조체인 Caveolae는 세포분열, 분화, 사멸, 노화 등 다양한 세포학적 현상의 조절에 핵심적인 기능을 하고 있다. Caveolae를 구성하는 Caveolin이 폐암 등에서는 종양억제유전자로, 전립선암 등에서는 발암유전자로 기능한다는 발견등에 기초하여 Caveolin 종양관련기능의 상반성, 조직특이성 및 종양악성화과정에서의 기능의 반전가능성을 분석하고자 한다. Caveolae와 종양증식, 사멸, 침윤, 전이 등과의 관련성이 지속적으로 제기된 반면 Caveolae/Caveolin의 종양관련기능에 대한 이해는 매우 미흡한 수준이다. 다양한 세포신호전달의 중심조절자로서의 Caveolae에 대한 이해는 분자적 진단 marker의 개발은 물론 악성종양의 발생 및 성장을 억제하는 새로운 치료기술개발의 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대되며 이에 대한 기반지식을 확보하기 위하여 아래와 같은 세부과제별 목표를 설정하였다.
제1세부과제: Caveolin 기능반전의 분자적 기전 및 조직특이성에 대한 분석
1. 악성종양세포의 세포분열 및 사멸에 미치는 Caveolin의 영향 및 조직특이성에 대한 연구
2. 종양특이적 Caveolin 신호전달계의 분자적 특이성에 대한 연구
제2세부과제: 암전이에 관여하는 shear stress 의존적 Caveolae 신호전달경로
1. Shear stress에 대한 혈관세포의 세포학적 반응에 있어 Caveolin과 Integrin의 역할 규명
2. 암세포의 혈관세포부착에 미치는 shear stress의 영향, Integrin과 Caveolin 역할 및 신호전달기전 분석
제3세부과제: 정상세포와 악성종양세포 lipid raft에 대한 targeted proteomics
1. Lipid raft 단백질 정제기술 확립 및 종양세포 특이적 lipid raft 단백질 분리동정
2. 악성종양세포 특이적 lipid raft 단백질들에 대한 proteomics 분석과 임상적 응용가능성 모색
●연구방법
(1) 15종의 인체 위암세포주와 120예의 악성위암조직을 대상으로 Caveolin 유전자의 발현 및 분자적 변이에 대한 translational study를 quantitative RT-PCR, genomic-PCR, Northern, Southern, Western blot, PCR-SSCP, methylation assay 등을 통해 수행하였다.
(2) WT-Caveolin, si-Caveolin transfection을 비롯하여 tumor-originated mutant 의 functional assay를 수행하여 cell proliferation, apoptosis, tumor growth에 미치는 영향을 분석하였다.
(3) 위암세포와 혈관내피세포와의 부착에 미치는 Caveolin의 영향을 Integrin, VCAM을 비롯한 adhesion molecule과의 interaction 여부를 중심으로 분석하였다.
(4) Lipid raft 단백질의 complete solubilization을 통해 암세포특이적 표식자를 분리동정하고 이차원전기영동과 ESI-MS/MS에 의하여 새로운 lipid raft 단백질의 존재를 확인하였다.
● 연구결과
제1세부과제
(1) 위암에서의 Caveolin 발현은 비정상적 감소 및 과발현의 양극화양상으로 관찰되며 초기종양은 발현감소가, 말기악성종양은 발현증가가 빈번하여 위암 악성화과정에서 Caveolin 기능의 oncogneic switch가 강하게 추론되었다.
(2) 세포주와 마찬가지로 primary gastric cancer에서의 Caveolin-1, 및 -2의 발현은 종양진행에 따라 감소 또는 증가의 양극화 양상을 보였다.
(3) 위암세포에서의 Caveolin 발현상실 또는 발현감소는 비정상적 promoter CpG island hypermethylation에 의한 epigenetic transcriptional silencing이 주요인이다. 또한 소수의 악성위암에서 Caveolin-1, -2 유전자의 dominant-negative mutant의 존재가 확인되었다.
(4) Caveolin-1의 발현은 위암세포의 apoptosis에는 큰 영향을 미치지 않는 반면 초기종양세포의 cell proliferation을 억제함으로서 tumor growth를 차단한다. 이에 반하여 악성종양세포에서 과발현되는 Caveolin-1은 cell proliferation을 촉진함으로서 tumor growth를 증가시킨다.
(5) Ha-Ras와의 collaboration에 의한 TGF-β1 기능의 oncogenic switch는 Caveolin과 XIAP의 결합에 의하여 매개된다.
(6) Caveolin-1은 IL-6의 mitogenic function을 유도함으로서 IL-6의 biphasic effect와 악성종양에서 IL-6 과발현의 이유를 뒷받침한다.
제2세부과제
(1) 위암세포의 VCAM 발현여부는 종양세포 원격전이의 필수적 전제의 하나인 carcinoma cell to endothelial cell adhesion의 핵심요인이다. VCAM의 partner인 Integrin alpha4 beta1을 차단할 경우 endothelial cell에 대한 carcinoma cell의 adhesion이 감소한다.
(2) p38 MAPK pathway는 carcinoma cell to endothelial cell adhesion의 핵심 조절기전이다.
(3) Caveolin-1 발현은 carcinoma cell to endothelial cell adhesion을 증가시킨다. siRNA 등을 통하여 Caveolin-1의 발현을 억제시켰을 경우 종양세포의 내피세포부착이 현저히 억제된다.
(4) 종양세포의 Caveolae는 혈관내피세포에의 부착에 촉진함으로서 악성종양세포의 원격전이를 유도하는 oncogenic function을 가진다.
제3세부과제
(1) Lipid raft의 분리 및 lipid raft 단백질의 complete solubilization: Lipid raft를 30℃에서 Triton X-100로 반응시키거나 octyl glucoside를 사용함으로써 대부분의 lipid raft 단백질의 용해를 유도할 수 있었다.
(2) 정상세포와 암세포에서 분리한 lipid rafts의 2-D gel analysis: 암세포 특이적 표식자를 찾기 위하여 H-Ras가 과발현된 NIH3T3에서 lipid raft 단백질을 추출하였으며 ESI MS/MS로 분석하여 특이적 단백질의 존재를 확인하였다.
(3) Proteomics를 이용한 ubiquitous lipid raft 단백질의 동정 및 확인: ubiquitous lipid raft 단백질의 확인을 위해 계면활성제 불용해성과 저밀도성을 이용하여 다양한 조직으로부터 lipid raft를 분리하였다. Caveolin-1은 간, 폐, 신장의 lipid raft 분획에 독점적으로 농축되어 있었으며 또 다른 lipid raft 표식단백질인 flotillin-1은 뇌조직의 lipid raft에서 확인되었다.
(4) 이차원전기영동과 ESI-MS/MS에 의하여 새로이 확인된 단백질들은 ATP synthase β, disulfide isomerase A3, peroxiredoxin 6, thioredoxin peroxidase 6, Raf kinase interacting protein 등으로서 이들은 각각의 항체로 immunoblot하여 그 존재를 검증하였다.

Abstract ▼

● Purpose of Study
Caveolae is a invaginated plasma membrane where various signaling molecules critical for cell proliferation, differentiation, apoptosis and senescence are concentrated. Based on previous reports that Caveolin-1, a major structural component of Caveolae, acts as a tumor suppress

● Purpose of Study
Caveolae is a invaginated plasma membrane where various signaling molecules critical for cell proliferation, differentiation, apoptosis and senescence are concentrated. Based on previous reports that Caveolin-1, a major structural component of Caveolae, acts as a tumor suppressor in many human cancers but plays oncogenic roles in some other cancers including prostate carcinoma, we will investigate the molecular basis underlying the oncogenic switch of Caveolin function in human carcinogenesis. Molecular understanding of the tumor-specific function of Caveolae will improve our knowledge for the identification of useful markers for diagnosis and will provide valuable information for the development of new preventive and therapeutic strategies for better treatment.
The 1st Project: Analysis of oncogenic switch of Caveolin and its tissue specificity
1. Effect of Caveolin on tumor cell proliferation, apoptosis, and its tissue specificity
2. Molecular analysis of tumor-specific properties of the Caveolin signaling pathway
The 2nd Project: Characterization of shear stress-dependent Caveolae signaling and its association with metastatic potential of tumor cells
1. Role for Caveolin and Integrin in endothelial response to shear stress
2. Effect of shear stress on tumor cell adhesion to endothelium; role of Integrin and Caveolin
The 3rd Project: Targeted proteomic analysis of tumor cell lipid raft
1. Development of purification method for Lipid raft proteins
2. Isolation and characterization of tumor cell-specific lipid raft proteins
3. Proteomic analysis of tumor-specific lipid raft proteins and its clinical implication
● Methodology
(1) Translational study of Caveolins in human gastric cancer: expression and mutational analysis of Caveolins using 15 cancer cell lines and 120 primary gastric adenocarcinomas by quantitative PCR, Northern, Southern, Western blot, PCR-SSCP, methylation assays.
(2) Functional analysis for Caveolin effect on cell proliferation, apoptosis, and tumor growth using transfection of WT-Caveolin, si-Caveolin, and tumor-originated mutant alleles.
(3) Molecular and cell biological characterization of Caveolon effect on tumor cell adhesion to endothelium and its association with Integrin, VCAM, and other adhesion molecules.
(4) Development of new methodology for complete solubilization of lipid raft proteins and its application for identification of tumo-specifc markers
(5) Identification of new lipid raft proteins using 2-D gel electrophoresis and ESI-MS/MS
● Results
The 1st Project
(1) Both reduction and overexpression of Caveolin was identified in gastric cell lines and primary tumors; abnormal reduction was frequently found in early cancers whereas abnormal overexpression was frequently observed in advanced cancers, suggesting the oncogenic switch of Caveolin function in the malignant progression of gastric cancers.
(2) Loss or abnormal reduction of Caveolin expression is strongly associated with aberrant promoter CpG island hypermethylation, indicating the epigenetic transcriptional silencing of Caveolin in gastric cancers. Point mutations of Caveolins are also identified in some cancers.
(3) Caveolin-1 inhibits cell proliferation of early stage cancers via suppression of DNA replication whereas it stimulates cell proliferation of advanced late stage cancers. Caveolin expression does not significantly affect tumor cell sensitivity of apoptosis.
(4) Oncogenic switch of TGF-β1 through the functional collaboration with Ha-Ras is mediated by direct interation between Caveolin and XIAP.
(5) Caveolin-1 expression induces the mitogenic function of IL-6 function and thus biphasic role for IL-6 in tumorigenesis
The 2nd Project
(1) Expression of VCAM is a critical factor for carcinoma cell to endothelial cell adhesion, which is a prerequisite for distant metastasis of cancer cells. Blockade of Integrin α4β1, a functional partner of VCAM, significantly down-regulates tumor cell adhesion to endothelium.
(2) Activation of p38 MAPK is required for carcinoma cell to endothelial cell adhesion.
(3) Caveolin-1 expression increases adhesion capability of tumor cell to endothelium and knockdown of Caveolin-1 expression using siRNA approach leads to a marked reduction of tumor cell adhesion to endothelium.
(4) Adhesion-promoting role of Caveolae is tightly associated with its oncogenic property by enhancing the metastasis potential of tumor cells.
The 3rd Project
(1) Isolation of lipid raft and complete solubilization of lipid raft proteins: application of Triton X-100 (reaction at 30℃) or use of octyl glucoside results in nearly complete solubilization of lipid raft proteins.
(2) 2-D gel analysis of lipid rafts of normal and tumor cells: tumor cell specific lipid raft proteins were identified in H-Ras-tranformed NIH3T3 cells using ESI MS/MS analysis.
(3) Identification and characterization of ubiquitous lipid raft proteins using proteomics: ubiquitous lipid raft proteins were isolated from multiple tissues. Caveolin-1 was observed to be concentrated in liver, lung and kidney but not in brain, where flotillin-1, another marker for lipid raft, was found in brain tissue.
(4) newly identified proteins by 2-D gel exlectrophoresis and ESI-MS/MS include ATP synthase β, disulfide isomerase A3, peroxiredoxin 6, thioredoxin peroxidase 6, and Raf kinase interacting protein. Lipid raft localization of these proteins was verified using immunoblot analysis.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 3
• 목 차 ... 4
• 요약문 ... 5
• SUMMARY ... 7
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 22
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 34
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당함): 해당사항 없음 ... 36
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 36
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 42
• 제 1 세부연구개발과제 연구결과 ... 43
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 44
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 48
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 50
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 59
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 ... 60
• 6. 참고문헌 ... 64
• 제 2 세부연구개발과제 연구결과 ... 67
• 1. 제 2 세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 68
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 70
• 3. 제 2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 71
• 4. 제 2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 75
• 5. 제 2세부연구개발과제의 연구성과 ... 76
• 6. 참고문헌 ... 79
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 80
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 81
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 82
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 84
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 92
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 ... 93
• 6. 참고문헌 ... 97