초록 ▼

병원성 아메바인 Naegleria fowleri로부터 클로닝된 nfa1 유전자는 360개의 핵산으로 구성되어있고, 발현된 단백질인 Nfa1 (13.1 kDa)은 전자현미경상에서 아메바의 위족에 분포하는 것으로 이전 연구에서 보고되었다. 비병원성 아메바인 N. gruberi는 nfa1 유전자를 가지지만, 발현 단백질은 Nfa1에 대한 항체로 western blotting을 한 결과 관찰되지 않았다. 같은 자유생활 아메바에 속하는 A. royreba를 제외하고 다른 Acanthamoebae 또한 nfa1 유전자를 가지는 것을 역전사 중

병원성 아메바인 Naegleria fowleri로부터 클로닝된 nfa1 유전자는 360개의 핵산으로 구성되어있고, 발현된 단백질인 Nfa1 (13.1 kDa)은 전자현미경상에서 아메바의 위족에 분포하는 것으로 이전 연구에서 보고되었다. 비병원성 아메바인 N. gruberi는 nfa1 유전자를 가지지만, 발현 단백질은 Nfa1에 대한 항체로 western blotting을 한 결과 관찰되지 않았다. 같은 자유생활 아메바에 속하는 A. royreba를 제외하고 다른 Acanthamoebae 또한 nfa1 유전자를 가지는 것을 역전사 중합효소반응에 의해 확인되었다. 이러한 사실은 nfa1 유전자가 시험관 내 세포독성 및 생체 내 병원성과 연관성의 존재 가능성을 제시하고 있다.
본 연구에서는, nfa1 유전자를 비병원성 아메바인 N. gruberi에 transfection하여 nfa1 유전자가 세포독성 및 병원성과 관련이 있는지를 확인하였다. Transfection을 위해 CMV promoter와 GFP 유전자를 포함하는 진핵세포 transfection 벡터인 pEGFP-C2를 기초로 하여 pEGFP-C2/nfa1, pEGFP-C2/nfa1UTR (nfa1UTR; 5' UTR, nfa1 ORF, 그리고 3' UTR이 포함됨), 그리고 ubiquitin promoter가 들어간 벡터가 제작되었다. SuperFectTM 시약을 이용하여 transfection 한 후, transfection 된 N. gruberi로부터 발현되는 GFP 단백의 형광이 세포질에서 관찰되었고 그 아메바는 G418 항생제를 이용하여 selection 하면 그 후 약 9개월 동안 유지되었다. Transfection 된 nfa1 유전자가pEGFP-C2/nfa1UTR 벡터가 주입된 N. gruberi의 genomic 핵산내에 융합되었다는 것이 벡터와 nfa1 유전자에 특이적인 primers를 이용하여 중합효소 반응에 의해 확인하였다. 벡터가 주입된 N. gruberi에서 nfa1 유전자와 GFP 유전자의 발현이 역전사 중합효소반응을 이용하여 확인되었다. 발현된 단백질은 Nfa1에 대한 항체를 이용하여 western blotting을 통해 분자량이 약 13.1 kDa이라는 것을 확인하였다. 마지막으로, pEGFP-C2/nfa1UTR 벡터가 주입된 N. gruberi는 CHO 세포에 대한 시험관 내 세포독성을 유발할 수 있었지만, BALB/c 마우스의 생체 내 병원성 유발에는 영향을 미치지 않았다. 결론적으로, 본 연구자는 N. gruberi에 대한 transfection 시스템을 처음으로 확립하였다. 그리고, N. gruberi 로의 stable tranfection 시스템이 본 연구 방법을 이용하여 확립되었고 nfa1 유전자로부터 발현된 Nfa1 단백질이 N. gruberi의 생체 내 병원성이 아니라 시험관 내 세포독성을 증가시킬 수 있었는데, 이러한 사실은 아메바의 생체 내 병원성에 있어서 또 다른 요소(들)이 관련될 수 있다는 사실을 제시하고 있다.

Abstract ▼

The nfa1 gene cloned from pathogenic amoeba, Naegleria fowleri consists of 360 bp and encodes the Nfa1 protein (13.1 kDa) which is located in pseudopodia of the amoeba by immunochemistry as shown in the previous paper. On the contrary, in nonpathogenic N. gruberi having an nfa1 gene, the Nfa1 protei

The nfa1 gene cloned from pathogenic amoeba, Naegleria fowleri consists of 360 bp and encodes the Nfa1 protein (13.1 kDa) which is located in pseudopodia of the amoeba by immunochemistry as shown in the previous paper. On the contrary, in nonpathogenic N. gruberi having an nfa1 gene, the Nfa1 protein was not detected by western blotting using an anti-Nfa1 antibody. It was identified that other free-living amoebae, Acanthamoeba spp. except for nonpathogenic A. royreba had an nfa1 gene by RT-PCR, which suggested the possible involvement of nfa1 gene in in vitro cytotoxicity and in vivo pathogenicity of N. fowleri.
In this study, DNA of the nfa1 gene was transfected into nonpathogenic N. gruberi to address whether the nfa1 gene cloned from N. fowleri is related with in vitro cytotoxicity and in vivo pathogenicity. Eukaryotic transfection vector, pEGFP-C2 containing a CMV promoter and GFP gene, was used. Experimental vector was pEGFP-C2/nfa1UTR (nfa1UTR containing 5' UTR, nfa1 ORF, and 3' UTR). After transfection using SuperFectTMreagent, the green fluorescence expressed from N. gruberi transfected with pEGFP-C2/nfa1UTR vector was observed in the cytoplasm of N. gruberi and the transfected N. gruberi was preserved over 9months by G418 selection. The transfected nfa1gene was observed by PCR using nfa1- and vector-specific primers from the genomic DNA of N. gruberi transfected with pEGFP-C2/nfa1UTR vector. The nfa1 and GFP gene were also identified by RT-PCR in the transgenic N. gruberi. The Nfa1 protein from the transgenic N. gruberi was expressed and identified as a 13.1 kDa of band by western blotting using an anti-Nfa1 antibody. Finally, N. gruberi transfected with pEGFP-C2/nfa1UTR vector could induce the in vitro cytotoxicity but not in vivo pathogenicity. In conclusion, I have established an efficient transfection system for N. gruberi for the first time. Stable transfection into N. gruberi was established by using my system and the expressed Nfa1 protein enhanced in vitro cytotoxicity of N. gruberi but not the in vivo pathogenicity, suggesting the possible involvement of another factor(s) for in vivo pathogenicity of amoeba.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 3
• 목 차 ... 4
• 요약문 ... 5
• Summery ... 6
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 7
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 12
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 12
• 4. 사업화 목표 달성도 및 계획 (해당 사항 없음) ... 27
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 27
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 31
• 7. 첨부서류 ... 31