초록 ▼

Ⅰ. 연구개발사업의 목적
조산은 전체 분만의 약 10% 를 차지하며, 주산기 사망과 이환의 가장 중요한 원인이다. 또한 조산 자체와 신생아 집중치료의 후유증으로 인한 뇌성마비, 농아, 맹아 등의 선전성 장애가 양산되어 조산은 개인과 가정의 불행일 뿐 아니라 사회적 문제로 부각되고 있는 상태이다. 본 연구의 최종 목표는， 1) 조산의 발생기전 규명， 2)조산의 고위험군을 선별하논 비침습적 표식자(rnarker) 개발，3) 정확한 자궁내 감염의 진단법 개발，4) 조산의 고위험군을 대상으로 적극적 치료를 시행하는 임상시험을 통하여

Ⅰ. 연구개발사업의 목적
조산은 전체 분만의 약 10% 를 차지하며, 주산기 사망과 이환의 가장 중요한 원인이다. 또한 조산 자체와 신생아 집중치료의 후유증으로 인한 뇌성마비, 농아, 맹아 등의 선전성 장애가 양산되어 조산은 개인과 가정의 불행일 뿐 아니라 사회적 문제로 부각되고 있는 상태이다. 본 연구의 최종 목표는， 1) 조산의 발생기전 규명， 2)조산의 고위험군을 선별하논 비침습적 표식자(rnarker) 개발，3) 정확한 자궁내 감염의 진단법 개발，4) 조산의 고위험군을 대상으로 적극적 치료를 시행하는 임상시험을 통하여 조산의 예방 및 치료법 확립함이다.
Ⅱ. 연구방법
제1세부과제에서는 양수내 MMP-8(Matrix Metalloproteinase-8)으로 조산 고위험군을 선별하고 병합 향생제 등 적극적 치료를 함으로써 조산의 예방 효과를 확인하고자 하였다. 또한, 자체개발한 MMP-8 정성검사 kit의 효용성을 검증하고, 이를 조기분만진통 산모에 적용하여 적극적 치료의 효과를 확인하고자 하였다. 제2세부과제에서는 조산의 비침습적 예측 표식자를 발굴하고 그 효용성을 증명하고자, 프로테오믹스 기법(이차원 전기영동 및 'MALDI-TOF，SELDI-TOF)을 도입하고，가능성이 알려진 표식자의 효용성을 검증하고자 하였다. 제3세부과 제에서는 여러 자궁내 감염균에 대한 신속하고 민감한 검출 방법을 개발하여 임상 검체에 적용하고자，중합효소연쇄반응(PCR)，multiplex PCR 및 hybridization, real-time PCR 등의 방법을 도입하였다. 제4세부과제에서는 태아와 태반을 중심으로 한, 조산에 관련된 생물학적 인자의 규명을 위하여，cytokine 및 MMP의 조절에 관여하는 기전，양수내 백혈구의 유전자형 분석, 조산 억제 수단의 개발을 시행하고자 하였다.
Ⅲ. 연구결과
제1세부과제에서는 12개의 병원을 포함하는 다기관연구로서 무증상 임신중기 산모에서 11774건의 양수검사 중 양수내 MMP-8 이 상승한 120례(치료군 병원 70례, 대조군 병원 50례)를 연구 대상으로 등록하였다. 임신중기 무증상 산모의 양수내 MMP-8 이 상승된 조산 고위험군에 대하여 적극적 치료를 시행한 군에서는 임신 34주 미만의 조산이 7% (3/43)로 대조군 병원의 27% (11/41)로 현저히 감소하였다 (P=0,02), 그러나，quasi-randoIIuzation을 적용한 분석에서는 연구대상군의 수가 1/2로 감소하여 통계적 유의성에 이르지는 못하였으나， 34주 미만의 이른 조산율이 대조군 병원에서는 30 .8%인데 반하여，치료군 병원에서는 18.2%(OR 0.5), 치료군 병원중 항생제 치료를 받은 산모에서는 12.5%(OR 0.32)로 적었다. 자체개발한 MMP-8 kit를 임상 양수 검체에 적용하였을 때， 민감도 99%, 특이도 97%로 높은 진단적 효용성을 확연하였으며， 이 킷트를 조기분만진통 산모에 적용하고 적극적인 항생제 치료를 하였을 때, 과거 통상적 치료 환자에 비하여 48시칸 이내 분만, 낮은 아프가 점수가 유의하게 적었으며, 조직학적 융모양막염과 신생아 이환도 적어지는 경향을 보였다.
제2세부과제에서는 새로운 표식자 탐색을 위하여 이차원 전기영동 및 MALDI-TOF 방법을 적용하였고, 여기서 조산의 표식자로 양수내 X-protein 이 발굴, 동정되었고 Westem blotting과 ELISA법으로 확인되었다. 그러나， 113례의 임상 검체로 확대 적용하였을 때에 유의한 농도 차이를 보이지 않았다. 표식자 MMP-8, MMP-9을 각 검체 에 적용하였을 때, 무증상 양수, 조기양막파수 양수에서의 유용성을 확인하였으나, 제대혈액, 질분비물에서는 유의한 차이가 보이지 않았다. 보다 정밀하고 재현성이 높은 SELDI-TOF 기법을 도입하여 양수, 혈액, 질분 비물에 적용하여 후보 표식자를 발굴하였다. 특히, 산모 혈액내 H-protein 및 그 fragrnent는 매우 유망하여 향후 연구에 활용될 예정이다.
제3세부과제에서는 10가지 미생물에 대하여 PCR 기법을 확립하였고，90례의 양수에 적용하여 16건에서 균을 검출하였다. 새로운 기법인 multiplex PCR 및 hybridizatíon을 도입, 임상검체에 적용하였으나 진단적 효용성이 높지 못하였다. 여러 균종에 대한 real-tirne PCR 기법을 확립하고 약 200여개의 임상검체에 시험하였으며, 신뢰성 있게 균 DNA를 정량적으로 검출할 수 있었다. 조기진통산모의 양수내 Ureaplasma PCR은 조산 및 불량한 주산기 예후를 예측할 수 있었고, 조산아에서 제대혈에서 PCR로 Ureaplasma가 검출된 경우 조직학적 융모양막염과 제대염의 빈도가 높았다. 그리고, 조기양막파수 산모에서 PCR을 적용하고 적극적 병합 항생제 요법으로 치료를 하였을 때, 과거 통상적 치료군에 비하여 조직학적 융모양막염과 제대염이 적었다.
제4세부과제에서는 태반을 중심으로 조산의 발생 기전을 연구하였다. 조산아와 만삭아의 cytokine 및 MMP 유전형에서 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 자궁내 감염시 양수내의 중성구는 태야 기원임올 확인하였으며, 그 유래는 융모판의 혈관일 가능성이 높음을 보였다. 태령에 따른 태아세포의 염증 반응을 살펴보았을 때， 세균내독소는 protein kinase C, MAPK, NFkB 등을 활성화시켰으며, 태령이 낮은 경우에 그 변화가 더욱 현저하였다. 세균내독소를 처리한 태아세포에서 비타민 C를 전처리하였을 때 염증반응이 감소하여, 향후 임상에 적용하는 연구가 유망할 것으로 생각된다.

Abstract ▼

Ⅰ . Objectives
Preterm delivery comprises about 10% of total births, and it is a major cause of perinatal mortalities and morbidities. And the sequelae of preterm birth and neonatal intensive care produces cases of cerebral palsy, deafness, and blindness, causing pain to the individual and the fa

Ⅰ . Objectives
Preterm delivery comprises about 10% of total births, and it is a major cause of perinatal mortalities and morbidities. And the sequelae of preterm birth and neonatal intensive care produces cases of cerebral palsy, deafness, and blindness, causing pain to the individual and the family, and it has also become the social problem. The key objectives of this project are 1) the elucidation of the mechanism of preterm birth, 2) the search of noninvasive markers for screening those who are at high risk for preterm birth, 3) the development of accurate diagnostic method for intra-uterine infection, and 4) the prevention and treatment of preterm birth by active management of the screened high-risk patients.
Ⅱ. Methods
In the first sub-project, we tried to examine the preventive effect of active managementincluding combined antibiotic regimen to those screened as high risk of preterm birth. And, we tried to prove the usefulness of newly developed :MMP-8 qualitative test kit and to examine the effect of active management applying this kit for preterm labor patients. In the second sub-project, we adopted the proteomic techniques (2D electrophoresis and MALDI-TOF, and SELDI-TOF) to search for the non-invasive markers of preterm birth and prove its usefulness. And we also tested the clinical usefulness of some of the already promising markers. In the third sub-project, we used the method of polymerase chain reaction (peR), multiplex peR and hybridization, and real-time peR to develop the rapid and sensitive detection method for various intra-uterine pathogens. In the fourth sub-project, we interrogated the mechanism which is involved in the cytokine and MMP regulation, analyzed the genotype of intra-amniotic white blood cells, and probed the development of inhibitory methods of the preterm birth, in order to elucidate the biological factors related to preterm birth, on the basis of fetus and placenta.
Ⅲ. Results
In the first sub-project, the multi-center trial including 12 hospitals enrolled 120 cases of elevated amniotic fluid MMP-8 (70 cases in the treatment group hospital, 50 cases in control group hospital) out of 11774 amniocenteses in the asymptomatic mid-trimester women. The rate of preterm birth before 34 weeks in the actively treated women among those with high risk for preterm birth (elevated intra-amniotic :MMP-8 in mid-trimester asymptomatic women) significantly decreased than the rate in the control group (7%[3/43] vs 27%[11/41], P=0.02).
However, in the analysis with quasi-randomization the number of study subject diminished by a half, so that we could not prove with statistical significance; but the rate of preterm birth before 34 weeks in the treatment group hospital or in the treated women was lower than that in the control group hospital (18.2% vs 30.8%, OR 0.5; 12.5% vs 30.8%, OR 0.32). When the newly developed MMP-8 kit was applied to the clinical amniotic fluid samples, it demonstrated high diagnostic performances with sensitivity of 99% and specificity of 97%. When the women with premature rupture. of membranes were actively managed with the application of the MMP-8 kit, the rates of the delivery within 48 hours and low Apgar score were significantly lower than those of the historic control group, and the rate of histologic chorioamnionitis and neonatal morbidity showed the tendency of decrease.
In the second sub-project, we utilized the technique of 2D electrophoresis and MALDI-TOF to search for a new marker, and X-protein was found and identified as a preterm birth marker and it was confirmed with Western blotting and ELISA. However, this marker, when measured in the extended 113 clinical samples, could not show statistical difference in concentrations. When the already promising markers, MMP-8 and MMP-9, were applied to clinical samples, we demonstrated the usefulness in the amniotic fluid of asymptomatic women and preterm premature rupture of membranes patients, but not in the cord blood and vaginal discharge. We adopted the SELDI-TOF technique (which is more accurate and reproductive) to the samples of amniotic fluid, blood, and vaginal discharge, and we found the candidate marker peaks. Especially, H-protein and its fragment in the maternal blood was very promising, and it will be applied in the future research.
In the third sub-project, we set up the PCR technique for 10 more bacteria, and we applied it to 90 samples of amniotic fluid and detected 16 microbes. The new method, multiplex PCR and hybridization, was set up and applied to the clinical samples, but it failed to show a good diagnostic performances. We settled the real-time PCR technique for various microbes and applied it to about 200 clinical samples, so that we could assess conSistently the microbial DNA quantity. The amniotic fluid Ureaplasma peR applied to preterm labor patients could predict the preterm delivery and poor perinatal outcomes, and the positive result of cord blood Ureaplasma PCR in preterm babies was found to indicate the higher rates of histologic chorioamnionitis and funisitis. When women with preterm premature rupture of membranes were managed actively with the application of PCR and with the use of combined antibiotic regimen showed the lower rates of histologic chorioamnionitis and funisitis than historic controls.
In the fourth sub-project, we looked into the pathogenetic mechanism of' preterm birth on the basis of placenta. The genotypes of cytokine and MMP polymorphisms in pre term and term delivery did not show statistically significant differences. We verified that the amniotic fluid neutrophils in the intra-amniotic infection were of fetal origin, and its source is likely to be from the chorionic plate vessels. When we examined the inflammatory responses of fetal cells according to the gestational age, the bacterial endotoxin activated the protein kinase C, MAPK, and NFkB, and their responses were more intense in the lower gestational ages. When endotoxin-stimulated fetal cells were pretreated with vitamin C, the inflammatory response diminished, making the future application in the clinical setting more promising.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 요약문 ... 6
• SUMMARY ... 8
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 10
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 12
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 맞 결과 ... 27
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 49
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 54
• 5. 연구개발결과의 파급효과 ... 87
• 6. 참여연구원 편성표(총괄) ... 91
• 8. 첨부서류 ... 92
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 136
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 138
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 146
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 150
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 155
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 ... 157
• 6. 참고문헌 ... 162
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 164
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 166
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 175
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 180
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 표찰 및 결론 ... 192
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 ... 195
• 6. 참고문헌 ... 206
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 208
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 210
• 2. 제3세부연구깨발과제의 연구대상 및 방법 ... 220
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 225
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 232
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 ... 235
• 6. 참고문현 ... 248
• 제4세부연구개발과제 연구결과 ... 250
• 1. 제4세부연구개 발과제 의 최종 연구개 발 목표 ... 252
• 2. 제4세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 258
• 3. 제4세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 259
• 4. 제4세부연구개발과제의 연구결과 고찰 빛 결론 ... 265
• 5. 제4세부연구개발과제의 연구성과 ... 267
• 6. 참고문헌 ... 278