초록 ▼

연구의 필요성 및 목적 : 글리벡 (Gleevec. STI571)이 만성골수성백혈병(chronic myeloid leukemia: CML)의 발병 초기에서는 탁월한 효과를 보이나 이미 글리벡에 대한 내성이 점차 늘어나는 추세이며 진행된 질환에서는 그 효과가 현저히 떨어진다. 글리벡에 내성을 초래하는 분자생물학적 기전을 발굴함으로써 1)글리벡의 적용을 최적화하여 치료 비용을 경감시키며 2)글리벡 저항성 백혈병의 새로운 치료법 개발에 도움을 줄 수 있을 것이다. 글리벡 내성이 처음부터 있거나 글리백에 대해 반응하다가 내성이 생기는 경우

연구의 필요성 및 목적 : 글리벡 (Gleevec. STI571)이 만성골수성백혈병(chronic myeloid leukemia: CML)의 발병 초기에서는 탁월한 효과를 보이나 이미 글리벡에 대한 내성이 점차 늘어나는 추세이며 진행된 질환에서는 그 효과가 현저히 떨어진다. 글리벡에 내성을 초래하는 분자생물학적 기전을 발굴함으로써 1)글리벡의 적용을 최적화하여 치료 비용을 경감시키며 2)글리벡 저항성 백혈병의 새로운 치료법 개발에 도움을 줄 수 있을 것이다. 글리벡 내성이 처음부터 있거나 글리백에 대해 반응하다가 내성이 생기는 경우에서 내성의 발생에 관여하는 유전자의 탐색 및 Bcr-Abl 단백의 작용기전을 규명하기 위하여 CML 세포에서 발현되는 단백질체 (proteomics pattern)를 분석하는 것이다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 글리벡에 대한 내성 기전 및 이에 관련된 유전자의 발현 양상을 밝힘으로써 prognostic molecular marker를 개발하고 새로운 치료법 개발의 토대를 구축하고자 한다.
연구 방법 : 연구 목표를 달성하기 위하여 글리벡의 내성에 관여하는 유전자의 탐색 및 탐색된 유전자의 기능을 분석하고자 한다. 이를 위하여 일차적으로 환자에서 확보한 여러 CML 세포를 이용하여 글리벡에 대한 민감성을 분석하고, 분석된 결과에 따라 내성 세포주와 내성이 없는 세포주를 확보한 후, suppression subtractive hybridization을 수행하여 내성을 갖는 세포와 내성을 갖지 않는 세포에서 차등 발현되는 유전자를 탐색한다. 또한 글리벡과 Bcr-Abl 단백의 상관 관련성을 FISH analysis를 통하여 분석하며, 그 밖의 다른 저해요인을 발굴하고자 한다. 유전자 발현에 따른 글리백의 효과 규명과 이에 따른 proteomics pattern을 규명하고자 CML 세포주와 CML 환자의 혈액시료에 대해서 글리벡을 투여하기 전과 투여한 후에 나타나는 단백질체의 변화를 2-D electrophoresis 혹은 SELDI-TOF를 통하여 분석한다. 글리벡이 투여된 후에 보이는 단백질체 패턴은 다양할 것이다. 기준시료와 비교하여 글리벡에 의한 효과가 있는 시료, 저항성이 있는 시료 등의 분석을 통하여 marker 단백질들을 동정할 것이다.
연구결과 : 만성골수성 백혈병의 진행에 과정에서 발현이 변화되는 유전자를 바탕으로 질병의 진행기전을 규명하고자 하였으며, 글리벡 내성에 관여하는 유전자의 발현 양상을 분석함으로 약제 내성 기전을 밝히고자하였다. 이를 위하여 제 1 세부 내에서 임상정보가 포함된 임상시료를 확보하였고, 이를 이용하여 subtractive hybridization, cDNA chip을 이용하여 차등발현 유전자를 확보하였으며, 이러한 유전자의 발현증가에 의하여 만성 골수성 백혈병의 생물학적 특성을 규명하고자 하였다. 만성기의 종양세포와 급성기의 종양 세포를 분석한 결과, 면역학적 특성을 유도하는 유전자와 글리벡에 의하여 세포고사를 유도하는 유전자가 다량 증가하는 것으로 나타났으며, 또한 DNA repair에 관련된 유전자가 다량 증가하는 것으로 관찰되었다. 본 연구 결과에 의하면 HLA family, ATF3, FLT3, IGI, NT5E, RGS1, GCK와 같은 유전자가 다량 증가하는 것으로 관찰되었다. 본 연구 결과에 의하여 HLA family, ATF3, FLT3, IGI, NT5E, RGS1, GCK와 같은 유전자가 다량 증가함으로 만성기에서 급성기로 전환할 수 있도록 종양세포의 특성을 변화하였으며, 이러한 유전자의 증가가 글리벡에 대한 내성을 극대화하는 것으로 관찰되었다.
이러한 유전자의 발현 억제할 수 있는 유도체가 만성기에서 급성기로 전환되는데 중요한 역할을 할 수 있다는 가설 아래 HDAC inhibitor, curcumin, proteosome inhibitor등의 항암제와 글리벡의 병합치료 효과를 관찰하였으며, 이러한 치료법이 만성기에서 급성기로 전환을 억제하는지 규명하였다. 병합처리 결과 HDAC inhibitor와 글리벡을 병합하여 처리하는 경우, 세포고사에 관련된 유전자와 DNA repair에 관련된 유전자들의 발현이 증가하는 것으로 관찰되었다.
제 2 세부: 1. 만성골수성백혈병 세포의 성장의 기전 규명. 2. 만성골수성백혈병의 단백체 양상 분석, 3. 글리벡처리에 따른 K-562 세포의 단백체 양상 분석 4. 글리벡 내성 세포주 (k-562R)에서 글리벡 처리에 따른 단백체 양성 분석 5. 글리벡 내성과 글리벡 처리와의 상관 관련성 규명 6. 글리벡에 의한 K-562 성장과의 상관성 규명, 7. K-562 세포에서 글리벡에 의한 Flow cytometry 분석 8. K562 cell에서 단백질의 발현 조절에 관여하는 유전자 분석. 9. K-562 세포주에서 글리벡에 의한 인산화 과정의 변화 분석
제 3 세부 : 글리벡을 투여하여 CML를 치료하는 과정에서 글리벡 내성인 CML 환자가 생겨나고 있다. 현재까지 알려진 글리벡의 내성의 원인은 추가적인 염색체이상, BCR/ABL gene의 point mutation, BCR/ABL gene amplification 등이 있다. Human leukemia $Bcr/Abl^{+}$ CML cell line인 K562 cell에 저농도의 Gleevec (0.1uM)을 처리하여 배양을 시작한 후 최종 1 uM 농도에 이를때까지 10일 간격으로 Gleevec 농도를 단계적으로 높여 처리하여 Gleeve-resistant CML 세포에 Gleevec을 처리할 때에 발현이 변하는 marker protein으로 Gleevec 사용에 대한 임상적 보조데이터로 개발하여 사용할 수 있을 것이다. 특히 위의 분석에서 10개의 unknown function proteins을 발굴하였다. 이들 unknown function proteins이 암화 과정에서 수행하는 역할을 규명할 것이다. CML은 Bcr-Abl의 constitutively active tyrosine kinase 기능에 의해서 유발된다. 따라서 Bcr-Abl에 의한 하위 신호전달 단계 단백질들의 tyrosine phosphorylation은 매우 중요하다. 이들 하위 단계 단백질들의 throsine phosphorylation을 방해한다. 이러한 방해는 암화를 예방하고 CML 세포 사멸로 유도하여 CML을 치료하게 된다. 즉, Gleevec 이 처리된 CML 세포에서는 tyrosine phosphorylation 이 변화되어 있으며 이는 암화들 억제하는 형태의 tyrosine phosphorylatíon 상태를 유지한다. Gleevec을 처리한 CML 세포와 Gleevec을 처리하지 않은 CML 세포에서 tyrosine phosphorylation이 변화된 단백질은 Bcr一Abl 의 작용점에 있는 단백질들이다 이들 단백질들을 분석하면 Bcr-Abl 단백질의 기능을 이해할 수 있고 또한 새로운 CML 치료제의 target protein 을 개발할 가능성을 기대해 볼 수 있다. 이러한 목적으로 Gleevec을 처리한 CML 세포와 Gleevec을 처리하지 않은 CML 세포에서 tyrosine phosphorylation이 변화된 단백질을 동정하였다. Gleevec을 처리하지 않은 CML 세포, 2.5 uM Gleevec을 24 시간， 72 시간 처리된 세포를 분석하여 tyrosine phosphorylation이 변화된 80개의 단백질을 발견하였고 이들 중 주요한 25개의 단백질을 동정하였다. 이들 25개 단백질은 계속적인 Gleevec의 작용 기전 연구에 이용될 것이다.

Abstract ▼

Research purpose: Even though Gleevec (STI571) showed the promising effects on chronic myeloid leukemia (CML) in early events of disease progression, the production of Glivec resistance dues to reduce the effect of Glivec to controll the progression of CML. Flucidating the molecular mechanism of Gli

Research purpose: Even though Gleevec (STI571) showed the promising effects on chronic myeloid leukemia (CML) in early events of disease progression, the production of Glivec resistance dues to reduce the effect of Glivec to controll the progression of CML. Flucidating the molecular mechanism of Glivec resistance in CML leads us as following benefits in treatment of CML; 1) reduction of fee for treatment of Glivec, 2) development of novel treatment for CML. For that, in, de novo or not, the production of resistant mechanism against identifying the novel genes associated with Glivec resistance will he identified and the interaction of Bcr-Abl with Glivec will be verified in proteomic patterns. Based on those experiments, we verified the mechanism of Glivec resistance through the identification of gene expression patterns associated with Glivec resistance. Our results provided the clues for molecular prognostic markers and advice the development of novel drugs for patients who have Glivec resistance.
Methods : For achieving for our research aims, identification of novel genes related to Glivec resistance and investigation of the function of those genes will be performed. For that, various CML cell lines obtained from CML patients was examined the response of Glivec. Based on results, CML cell lines were classified. After classifying CML cell lines agianst Glivec, differetially expressed genes were identify using SSH and eDNA chip. Also, identification of Glivec resistance in CML cell lines was used by FISH analysis. In additions, proteomics patterns were examined in CML cell lines and CML cells, obtained from various CML patients, depending on treatment of Glivec using 2-D electrophoresis or SELDI-TOF. We suggested that the proteomics patterns will be various in CML cells treated with Glivec. These patterns will be identified by comparison between normal control and experimental groups.
Research results: To investigate the mechanism of transition from chronic phase to blastic phase and novel genes related to be Glivec resistance, the novel genes associated with the progression of CML and Glivec resistance was identified. For that, in the first research group, clinical samples having clinical information were collected and SSH and cDNA chip analysis was performed using those samples and then differentially expressed genes were identified. Transition of chronic phase into blastic phase were characterized by patterns of gene expressions. The results showed that genes related to the immunologic responisveness in its progression. Apoptotic genes and DNA repair genes were increased in the CML cells treated with Glivec. In details, HLA family, ATF3, FLT3, IGI, NT5E, RGSl. GCK was dramatically increased to be the blastic phase of CML. Also, those genes, were associated with becoming the Glivec resistant CML cells. The second research group: 1. Cell proliferation assay of CML cells. 2. Analysis of proteomic patterns in CML cell lines, :3. Protcomic pattern of K562 cells with and without Gleevec treatment. 4. Proteomic pattern of K562-R cells with and without treatment of Gleevec, 5, Proteomic pattern of K562 and K562-R cells with treatments of Gleevec, 6. Effects of Gleevec on K562 cell proliferation (Growth of K562 cells), 7, Flow cytometric analysis for Gleevec-treated K562 cells. 8. Impact of Gleevec on mRNA expression of regulatory factors in K562 cells, 9. Identification of the phosphotyrosine proteome of K562 cells, The third research group: Glivec resistance was derived from the treatment of Glivec in CML patients. At present. additional chromosome abbreviation, BCR/ABL gene point mutation, and BCR/ABL gene amplification played a major role in being the Glivec resistance. We established Glivec resistant cell lines based on gradually increasing concentration of Glivec into Human leukemia $Bcr/Abl^{+}$ CML cell line (K562) And amplification of Bcr/Abl fusion protein was examined in Glivec resistant cell lines by FISH analysis. We identified different proteomic patterns between Gleevec-resistant CML and Gleevec-sensitive CML when treated with various concentration of Glivec. In 20 electrophoresis analysis, 118 proteins were different expression patterns between Gleevec-sensitive CML and Gleevec-resistant CML when those cells were treated with 1 uM of Gleevec. The expression patterns of those proteins will be used for identifying the biologic behaviors of CML in clinical process. Especially, 10 unknown function proteins were identified. We suggested that the function of unknown proteins by phosphorylation playa important role in the cell signalling pathway. Also, we will study the function of those protein to elucidate the mechanism of carcinogenesis by Bcr-Abl. CML could be explained by constitutively active tyrosine kinase of Bcr-Abl. Therefore, down-stream of Bcr-Abl tyrosine phosphorylation is very important to understand the resistance against Glivec. Many studies suggested that those proteins의 tyrosine phosphorylation of those proteins was associated with the progression of CML. Treatment of Gleevec inhibited the phosphorylation of down stream of Bcr-Abl. Its inhibition will be prevented from the transition from chronic phase to blastic phase and induced the apoptosis of CML cells. It suggested that CML cells treated with Gleevec induced the patterns of tyrosine phosphorylation and maintained the inhibition of CML progression by changing the patterns of phosphorylation in CML cells. The proteins have different phosphorylation between CML cells treated with Glivec and those cells without Glivec located in point view of Bcr-Abl protein. Verification of those proteins might help us to understand the function of Bcr-Abl protein and would be target protein of novel drugs for CML. For those purpose. proteins showing different patterns of tyrosine phosphorylation would be identified in treatment of CML cells with Glivec. 80 proteins showing different patterns of tyrosine phosphorylation was identified between control CML and CML cells treated with Gleevec (2.5 uM) for 72h. 25 proteins will be used for further analysis.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 목 차 ... 3
• 요약문 ... 4
• SUMMARY ... 6
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 8
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 15
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 15
• 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 17
• 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 39
• 7. 참여연구원 편성표(총괄) ... 40
• 8. 첨부서류 ... 40
• 제1세부연구개발과제 연구결과 ... 60
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 61
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 64
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과 ... 66
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 79
• 6. 참고문헌 ... 80
• 제2세부연구개발과제 연구결과 ... 81
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 82
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 86
• 3. 제2세부 연구 개발 과제의 최종 연구개발결과 ... 90
• 4. 제2세부 연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 113
• 6. 참고문헌 ... 114
• 제3세부연구개발과제 연구결과 ... 116
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 117
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법 ... 119
• 3. 제3세부 연구 개발 과제의 최종 연구개발결과 ... 124
• 4. 제3세부 연구 개발 과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 132
• 6. 참고문헌 ... 133