보고서 정보
주관연구기관 |
서울대학교 치과대학 College of Dentistry Seoul National University |
연구책임자 |
오석배
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2005-05 |
과제시작연도 |
2003 |
주관부처 |
보건복지부 |
과제관리전문기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201300001974 |
과제고유번호 |
1460003748 |
사업명 |
보건산업진흥(보건의료기술인프라개발) |
DB 구축일자 |
2013-05-20
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키워드 |
치통.형광염료.삼차신경절.삼차신경 중뇌핵.dental pain.fluorescent dye.trigeminal ganglion.mesencephalic ganglion.
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초록
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연구개발사업의 목적
1) 상아질 통증 및 치수 통증의 발생 기전을 연구하기 위한 in vitro 모델 개발
2) 치통 전달 세포와 치통 비전달 세포의 전기생리학적, 생물리학적 및 약리학적 특성을 파악
3) 치통 유발 혹은 진통 물질에 대한 치통전달세포의 반응을 알아봄으로써 치통 특이적 진통제를 개발하기 위한 기초 자료를 확립
연구방법
1) 통증 전달 신경세포로는 통증을 전달하는 신경세포의 말단만 존재하는 것으로 알려져 있는 쥐의 치아에 형광염료인 DiI를 주입한 후 삼차신경절 신경세포를 배양하여 형광이 보
연구개발사업의 목적
1) 상아질 통증 및 치수 통증의 발생 기전을 연구하기 위한 in vitro 모델 개발
2) 치통 전달 세포와 치통 비전달 세포의 전기생리학적, 생물리학적 및 약리학적 특성을 파악
3) 치통 유발 혹은 진통 물질에 대한 치통전달세포의 반응을 알아봄으로써 치통 특이적 진통제를 개발하기 위한 기초 자료를 확립
연구방법
1) 통증 전달 신경세포로는 통증을 전달하는 신경세포의 말단만 존재하는 것으로 알려져 있는 쥐의 치아에 형광염료인 DiI를 주입한 후 삼차신경절 신경세포를 배양하여 형광이 보이는삼차신경절 (trigeminal ganglion) 신경 세포를 찾아 통증 전달 신경세포를 확인할 수 있었음.
2) 통증 비전달 신경세포로는 고유수용성 감각섬유를 함유하고 있는 교근 혹은 하지조 신경에 형광 염료인 DiI를 주입한 후 삼차신경 중뇌핵 (tigeminal mesencephalic nucleus)에서 형광이 보이 신경세포를 찾아 통증 비전달 신경세포를 확인할 수 있었음.
3) 삼차신경절 신경세포는 통법에 따라 단일세포로 분리한 후 DiI로 염색된 세포를 대상으로 whole cell patch clamp 법과 칼슘 이미징의 기법을 이용하여, 치통 유발 혹은 진통 물질을 투여한 후의 그 반응성을 관찰하였다.
연구결과
형광염료 적용법을 통하여 통증 전달 세포을 확인한 후 whole cell patch clamp 법과 칼슘 이미징의 기법을 이용하여 실험하여 다음의 결과를 얻었다.
1) In vitro 통증 모델의 개발
흰쥐 치아에 형광염료인 DiI를 적용한 3주 후 삼차신경절 신경세포를 배양하여 형광현미경 아래서 관찰한 결과, 염색된 세포를 확인하여 치아에서 유래한 신경의 신경세포체임을 밝혔음.
2) Nociceptin의 칼슘전류 억제 기전 규명
기존의 연구를 통하여 진통 혹은 통증의 전달이나 조절에 기여한다는 많은 보고에도 불구하고 악안면 영역의 통증 분야에 대한 연구는 거의 없는 nociceptin에 대한 연구를 수행하였다. 악안 면영역의 감각 전달에 가장 넓은 분포를 가지고 있는 삼차 신경계를 대상으로 하여, 그 일차구심 섬유의 세포체가 존재하는 삼차신경절에서 nociceptin이 high-voltage-activated (HVA) 칼슘 전류에 미치는 영향을 기존의 opioid가 가지는 효과와 비교하여 다음의 결과를 얻었음. Nociceptin은 주로 크기가 작고 Isolectin B4에 염색이 되지 않는 세포에서 칼슘전류를 가역적으로 억제하였으며, 크기가 크고 Isolectin B4에 염색되는 세포들은 nociceptin에 반응을 보이지 않았다. 또한 Nociceptin에 반응을 보인 세포들의 대부분은 DAMGO에 의해서도 칼슘전류가 억제되었다. Nociceptin에 의한 칼슘전류의 억제는 prepulse facilitation 현상을 나타내고 N-ethylmaleimide에 의해 차단되는 것으로 보아 Gi/Go 단백질을 매개로 하여 일어남을 알 수 있었다. Nociceptin에 의한 칼슘전류의 억제는 opioid 수용체 길항제인 naloxone에 의해서는 차단되지 않았지만, 기존의 opioid 수용체와 구조적으로 유사한 opioid receptor like-1 (ORL-1) 수용체의 길항제인 UFP-101에 의해서는 차단되었다. 또한 μ-opioid 수용체가 transfection된 N-type 칼슘통로가 발현되어 있는 C2D7 세포에서 DAMGO는 칼슘전류를 억제하였지만, nociceptin은 그 효과를 보이지 않아, nociceptin은 μ-opioid 수용체가 아닌 ORL-1를 매개로 하여 작용하고 있음을 확인할수 있었음.
2) 유지놀에 의한 칼슘전류와 소디움 전류의 억제기전
유지놀은 치수염, 치수지각과민증을 포함한 여러 원인의 통증을 완화시키기 위해 치과 임상에서 많이 사용되고 있다. 최근 유지놀의 작용이 화학구조가 유사한 캡사이신의 수용체인 Transient receptor potential vanilloid 1 (TRPV1) 을 매개로 한다는 보고가 있지만, 유지놀의 진통작용이 TRPV1을 매개로 하지 않을 가능성이 있다. 막전압 의존성 칼슘 통로와 나트륨통로는 신경세포에 존재하는 주된 통로로 신경세포를 통한 신호 전달과 신경시냅스에서의 신경전달물질의 유리에 필수적으로 감각신경세포에서의 통증전달에도 중요한 역할을 담당하고 있다. 따라서 유지놀의 진통 기전을 밝히기 위해 치아에서 유래하는 삼차신경세포를 대상으로 하여 유지놀이 막전압 의존성 칼슘통로와 나트륨통로에 미치는 영향을 살펴보았다. 체중 200g 내외 흰쥐의 상악 구치부를 치과용 드릴을 이용하여 와동을 형성한 후 형광염료인 DiI를 적용하였다. 2주 후에테르로 경마취하고 흰쥐를 희생시킨 다음 삼차신경절 신경세포를 배양한 후 형광 현미경하에서 관찰하여 형광을 띄고 있는 세포가 치아에서 유래한 치성 구심신경세포임을 확인하였고, 이 세포를 대상으로 유지놀이 막전압 의존성 칼슘통로와 나트륨통로에 미치는 영향을 살펴보았다. 막전압 의존성 칼슘전류 (IBa)와 나트륨전류(INa)는 whole-cell patch clamp 법을 이용하여 기록하였는바 Axopatch-1C amplifier(Axon Instruments, Union City, USA)를 통해 기록되는 IBa와 INa를 pClamp8 software를 이용하여 추후에 분석하였다. 유지놀은 치성구심신경세포에서 막전압 의존성 칼슘전류를 농도 의존적으로 억제하였으며 그 효과는 가역적이었다. 유지놀은 치성구심신경세포에 존재하는 두가지 종류의 막전압 의존성 나트륨전류인 TTX-resistant 전류와 TTX-sensitive 전류를 가역적이고 농도 의존적으로 억제하였다. 유지놀에 의한 칼슘전류와 나트륨전류의 억제 작용은 TRPV1 길항제인 캡사제핀에 의해 차단되지 않았다. 유지놀은 N-type 칼슘통로가 발현되어 있는 C2D7 세포주에서 TRPV1이 발현되어 있지 않은 경우에도 N-type 칼슘전류를 억제하였다. 이상의 실험결과로 미루어 볼 때, 막전압 의존성 칼슘통로와 나트륨통로에 대한 억제작용이 유지놀의 진통효과에 기여하지만, 그 작용에는 TRPV1이 매개되지 않는 것으로 생각된다.
Abstract
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Purpose
1) Development of in vitro model for dental pain
2) Identification of mechanisms underlying dental pain and dentinal hypersensitivity
2) Identification of molecules specifically present in dental pain pathways.
3) To identify a transducer of dental pain.
Methods
1)
Purpose
1) Development of in vitro model for dental pain
2) Identification of mechanisms underlying dental pain and dentinal hypersensitivity
2) Identification of molecules specifically present in dental pain pathways.
3) To identify a transducer of dental pain.
Methods
1) Labeling of primary dental afferent neurons: identified by retrograde labeling with a fluorescent dye, DiI. (D-282, Molecular Probes, OR, USA).
2) Preparation of Trigeminal ganglion (TG) neurons from adult rats (n=50)
3) Heterologous expression system : HEK293 cells, C2D7 cells stably expressing the human N-type calcium channel encoded by the subunits a1B-a, b1b, a2bd
4) Generation of cDNA constructs: TRPV1, TRPM8, TRPA1
5) Electrophysiology
6) Calcium Imaging
7) Single cell RT-PCR
Results
1) Development of in vitro model for dental pain
When the acutely isolated TG neurons were visualized under fluorescent microscopy after 3 weeks of DiI crystal placement into both sides of maxillary molar, DiI labeled neurons, ~ 40 to 60 TG neurons per animal, were clearly detectable.
2) Molecular Mechanisms Underlying Calcium Current Modulation By Nociceptin
Nociceptinis a non-opioid peptide that modulates pain response. One of mechanism underlying its analgesic action is the inhibition of voltage-dependent calcium current (ICa), similar to that of opioids. We investigated the molecular mechanism by which nociceptin inhibits ICa using sensory neurons and a heterologous expression system. We found that ICa inhibition by nociceptin was voltage-dependent, exhibited the slowing of activation kinetics and prepulse facilitation, and was blocked by N-ethylmaleimide, indicating the involvement of , indicating Gi/Go protein. Also, the ICa inhibition by nociceptin was primarily mediated through binding to its own receptor, ORL-1, but not through affecting other m-opioid receptors. Thus, our results strongly demonstrate that heterologous cross-talk between ORL1 and mOR is not involved in the ICa inhibition by nociceptin.
3) Differential Effects of Transient Receptor Potential Vanilloid Ligands on Calcium Currents
We investigated if transient receptor potential vanilloid (TRPV) ligandswould modulate calcium currents in sensory neurons and the heterologous expression system. Capsaicin (a TRPV1 ligand) inhibited high-voltage-activated calcium channel (HVACC) currents in a subset of trigeminal ganglion neurons, whereas eugenol (a potential TRPV1 ligand) and icilin (a TRPA1 and TRPM8 ligand) inhibited HVACC currents in all TG neurons tested. We further studied if TRP ligands would modulate N-type calcium currents in C2D7 cells- stably expressing the human N-type calcium channel, where neither TRPV1, TRPA1 nor TRPM8 is endogenously expressed. Eugenol and icilin inhibited N-type calcium currents in C2D7 cells, but capsaicin did not. However, when TRPV1 was transiently expressed in C2D7 cells, capsaicin inhibited N-type calcium currents. Our results suggest that the activation of TRPV1 is required for the inhibition of HVACC currents by capsaicin, whereas the activation of specific TRP channels is not prerequisite for the inhibition of HVACC currents by eugenol and icilin.
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 3
- Ⅰ. 연구개발결과 요약문 ... 5
- (한글) ... 5
- (영문) ... 7
- Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
- 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 9
- 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 11
- 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 15
- 4. 사업화 목표 달성도 및 계획(개발과제만 해당) ... 16
- 5. 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 16
- 6. 연구개발결과의 파급효과 ... 29
- 7. 참여연구원 편성표 ... 30
- 8. 첨부서류 ... 31
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