보고서 정보
주관연구기관 |
(재)한국생활환경시험연구원 |
연구책임자 |
송경석
|
참여연구자 |
정재걸
,
김진식
,
성재혁
,
김용순
,
조현선
,
최병길
,
송민섭
,
류현열
|
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2009-11 |
주관부처 |
환경부 |
과제관리전문기관 |
국립환경과학원 National Institute of Environmental Research |
등록번호 |
TRKO201300007846 |
DB 구축일자 |
2013-05-20
|
키워드 |
다층벽탄소나노튜브.유전독성시험.세포독성.마이크로어레이.폐암.중피종.Multi-wall carbon nanotubes(MWCNTs).genotoxicity test.cytotoxicity.microarray.lung cancer.mesothelioma.
|
초록
▼
본 연구는 다양한 분야에서 가장 많이 개발되고, 사용되고 있는 탄소나노튜브(다층벽탄소나노튜브)에 대한 독성효과를 정확히 검증하기 위해 용매의 영향으로부터 안전한 다층벽탄소나노튜브(MWCNTs)의 정제방법을 개발하고 다층벽 탄소나노튜브의 형태학적 차이(High aspect ratio 및 Low aspect ratio)에 따라 독성 효과(유전독성)에 어떠한 영향을 주는지에 대한 연구와 중피종 및 폐암관련 유전자의 발현 패턴 분석 및 생물독성학적 반응 탐색을 수행하였다. 본 연구는 다층벽탄소나노튜브에 대한 다양한 물리적, 화학적, 생물학
본 연구는 다양한 분야에서 가장 많이 개발되고, 사용되고 있는 탄소나노튜브(다층벽탄소나노튜브)에 대한 독성효과를 정확히 검증하기 위해 용매의 영향으로부터 안전한 다층벽탄소나노튜브(MWCNTs)의 정제방법을 개발하고 다층벽 탄소나노튜브의 형태학적 차이(High aspect ratio 및 Low aspect ratio)에 따라 독성 효과(유전독성)에 어떠한 영향을 주는지에 대한 연구와 중피종 및 폐암관련 유전자의 발현 패턴 분석 및 생물독성학적 반응 탐색을 수행하였다. 본 연구는 다층벽탄소나노튜브에 대한 다양한 물리적, 화학적, 생물학적 자료들을 생산하였으며, 이들 자료들에 대한 국제적 검증을 통해 다층벽탄소나노튜브에 대한 건강 영향 평가에 대해 보다 정확하고 정밀한 기초자료를 확보하기 위해 본 연구를 수행하였다. 독성평가를 위하여 용매의 영향으로부터 안전한 MWCNTs 표준정제방법을 개발하고 MWCNTs 길이 제어를 위해 상업적으로 사용되는 MWCNTs(High aspect ratio)를 구매하여 열처리, 산처리, 초음파 처리를 통하여 길이가 제어되고, 물에서도 분산이 용이한 MWCNTs(Low aspect ratio)를 개발 및 제조하였다. 독성평가를 위해 사용될 MWCNTs에 대한 물리화학적 특성을 알아보기 위해 주사전자현미경(SEM), 동적광산란법(DLS), 열무게분석법(TGA), Brunauer, Emmett, Teller surface area(BET) 분석, 거시분산도를 측정하였다. 그 결과 각각의 탄소나노튜브는 High aspect ratio(545±230 nm, 10451±8422 nm)가 Low aspect ratio(192±80 nm)보다 더 긴 길이분포를 갖는 다는 것을 확인하였다. 각각의 분산도를 측정한 결과 1 %의 농도로 멸균증류수에 분산시킨 결과 High aspect ratio MWCNTs는 10 %미만의 거시분산도를 보인 반면 Low aspect ratio MWCNTs는 90 %이상의 분산도를 관찰 할 수 있었으며, High aspect ratio MWCNTs의 분산도를 높이기 위해 생체적합성을 갖는 분산제인 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC)용액에 분산시킨 결과 거시분산도가 15 %이상으로 증가하였으나 Low aspect MWCNTs는 30 %대로 감소하였다. 그러나 DPPC내에서도 Low aspect ratio가 High aspect ratio보다 분산도가 높음을 확인하였다. DPPC 용액을 이용하여 각각의 MWCNTs를 분산시킨 다음 3-battery로 유전독성시험(미생물을 이용한 복귀돌연변이시험, in vitro 염색체이상시험, in vivo 소핵시험)을 OECD 가이드라인 TG471, TG473, TG474에 따라 수행한 결과, High aspect ratio를 갖는 MWCNTs는 복귀돌연변이 시험(0~333 ug/plate), in vitro 염색체이상시험(직접법: 0~6.25ug/ml, 대사활성법: 0~25 ug/ml), in vivo 소핵시험(0~50 mg/kg)에 대해 유전독성을 관찰 할 수 없었으며, Low aspect ratio를 갖는 MWCNTs 또한 복귀돌연변이 시험(0~333 ug/plate), in vitro 염색체이상시험(직접법: 0~12.5ug/ml, 대사활성법: 0~50 ug/ml), in vivo 소핵시험(0~50 mg/kg)에 대해 유전독성을 관찰할 수 없었다. 시험결과 두종류의 MWNCNTs에 대한 유전독성은 관찰 되지 않았다. 그러나 직접법의 24시간 연속처리군 및 6시간 처리 18시간 회복군, 대사활성법의 6시간 처리 18시간 회복군에 있어서 CHO-k1세포주에 대해 High aspect ratio MWCNTs(GI50=12.942, 12.935, 41.897 ug/ml)와 Low aspect ratio MWCNTs(GI50=60.198, 40.481, 93.193ug/ml) 모두에서 세포독성을 관찰 할 수 있었으며, High aspect ratio가 Low aspect ratio보다 더 높은 세포독성을 보이는 것으로 관찰 되었다. NHBE 세포주를 이용해 상업적으로 사용되는 MWCNTs(High aspect ratio)에 대한 유전자 발현 패턴을 석면과 비교하기 위해 마이크로어레이 기법을 이용해 분석한 결과, 중피종 관련 유전자 중 13개의 유전자가 공통으로 2배 이상 증가하거나 감소하였으며, 폐암 관련 유전자 중 24개의 유전자가 공통으로 2배이상 증가하거나 감소하는 현상을 관찰 할 수 있었다. MWCNTs와 석면처리에 대해 시간대별로 구분하여 분석한 결과 induction 및 reduction된 유전자들의 발현패턴이 일정부분 유사한 것으로 나타났다. 즉, 석면과 High aspect ratio MWCNTs의 작용점(mode of action)은 유사할 가능성이 있을 것으로 관측되었다. High aspect ratio MWCNTs에 의해 regulation된 유전자(up- & down-regulated genes, 6 & 24 h)를 대상으로 data mining한 결과(pathway, gene ontology, genetic association), 다양한 signal transduction 현상에 관여하는 것으로 나타났다 (cell morphogenesis, angiogenesis, MAP kinase, cytokine interaction, STAT signaling 등).
Abstract
▼
To investigate of multi-wall carbon nanotubes(MWCNTS) toxic-effect, we manufactured surfactant-effect minimized and length controled MWCNTs and found biocompatible surfactant. Also, we performed to genotoxicity test and microarray analysis to find the genotoxicity and gene expression pattern for mes
To investigate of multi-wall carbon nanotubes(MWCNTS) toxic-effect, we manufactured surfactant-effect minimized and length controled MWCNTs and found biocompatible surfactant. Also, we performed to genotoxicity test and microarray analysis to find the genotoxicity and gene expression pattern for mesothelioma and lung cancer relative genes. This study produced physical, chemical and biological data which will be provided basic information for health effect evaluation through international verification. To evaluate of MWCNTs toxic-effect, we developed sufactant-effect minimized and length controled MWCNTs with commercial MWCNTs(High aspect ratio MWCNTs) which was treated heat, acid and sonication. So, we could manufacture water dispersible and length controled MWCNTs(Low aspect ratio MWCNTs). To find physico-chemical properties, we performed to scanning electron microscope(SEM) observation, Dynamic Light Scattering(DLS) analysis, Thermogravimetric analysis(TGA), Brunauer, Emmett, Teller surface area(BET) analysis and macrodispersion degree analysis. we knew that High aspect ratio MWCNTs(545±230 nm, 10451±8422 nm) were longer than Low aspect ratio(192±80 nm). High aspect ratio MWCNTs had below 10% of macrodispersion degree but Low aspect ratio MWCNTs had over 90 % degree at below 1 % MWCNTs concentration solution. Moreover, we found a biocompatible surfactant which is 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC) solution and measured macrodispersion degree in DPPC solution for both MWCNTs. The High aspect ratio MWCNTs had about 15 % degree but the Low was about 30 %. Nevertheless, The Low aspect ratio MWCNTs were more dispersive than the High in DPPC. To find mutagenic potential of MWCNTs, We performed to 3-battery genotoxicity test as bacterial reverse mutation test, in vitro chromosome aberration test and in vivo micronuclei test according to OECD test guideline 471, 473 and 474. We found that High aspect ratio MWCNTs had no genotoxicity for bacterial reverse mutation test (0~333 ug/plate), in vitro chromosome aberration test(without S9: 0~6.25 ug/ml and with S9: 0~25 ug/ml) and in vivo micronuclei test(0~50 mg/kg). Also, Low aspect ratio MWCMTs had no genotoxic effect for bacterial reverse mutation test (0~333 ug/plate), in vitro chromosome aberration test(without S9: 0~12.5 ug/ml and with S9: 0~50 ug/ml) and in vivo micronuclei test(0~50 mg/kg). However, we could find a cytotoxicity for both MWCNTs and there was a clear MWCNTs dose-dependant decrease in cell growth. High aspect ratio MWCNTs (GI50=12.942, 12.935 and 41.897 ug/ml) were more toxic than low (GI50=60.198, 40.481 and 93.193ug/ml) in 24 hours treat group(without S9 mix), 6 hours treatment group(without S9 mix) and 6 hours treatment group (with S9 mix). To analyze gene expression patterns for commercial MWCNTs(High aspect ratio) and asbestos, we performed microarray assay in NHBE cells. We observed 13 genes common up and down in mesothelioma relative gene and 24 genes common up and down in lung cancer relative gene for MWCNTs and asbestos treatment. In the results of data mining (pathway, gene ontology, genetic assocication), we knew that High aspect ratio MWCNTs took part in various signal transduction phenomenon as cell morphogenesis, angiogenensis, MAP kinase, cytokine interaction, STAT signaling etc.)
목차 Contents
- 표지 ... 1
- 제출문 ... 2
- 목차 ... 3
- 1. 최종보고서 요약문 ... 12
- (1) 요약문 ... 12
- (2) Summary ... 13
- 2. 연구의 배경 및 필요성 ... 14
- (1) 나노산업동향 ... 14
- (2) 국내외 연구동향 ... 19
- 1) 국외 연구동향 ... 19
- 2) 국내 연구동향 ... 21
- (3) 사업대상의 범위 ... 22
- 3. 연구방법 ... 25
- (1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성 분석 ... 25
- 1) 실험에 사용할 MWCNTs 선정 ... 25
- 2) 고온 열처리를 이용한 MWCNTs의 금속 촉매 제거 방법 개발 ... 25
- 3) 수계에서 분산제를 이용하지 않고 MWCNTs를 분산시킬 수 있는 분산기법 개발 및 길이 제어 ... 25
- 4) MWCNTs의 물리화학적 특성 분석 ... 26
- (2) 나노물질의 종류에 따른 유전독성반응성 비교연구 ... 30
- 1) 박테리아를 이용한 복귀돌연변이시험 ... 30
- 2) 포유류 배양세포를 이용한 염색체이상시험 ... 35
- 3) 설치류 조혈세포를 이용한 소핵시험 ... 41
- (3) 유전자칩을 이용한 나노물질 독성시험법 기반 구축 ... 47
- 1) Cell culture 및 High MWCNT 처리 ... 47
- 2) 생포생존율 분석(Cell viability assay; MTT assay) ... 47
- 3) Total RNA 추출 ... 48
- 4) DNA microarray 분석 ... 48
- 5) Data 분석(Mining) ... 50
- 4. 연구결과 ... 51
- (1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성분석 ... 51
- 1) 실험에 사용될 상업용 multi-wall carbon nanotube(MWCNTs)의 선정 및 길이가 제어된 MWCNTs 개발 ... 51
- 2) MWCNTs의 물리화학적 특성분석 ... 51
- (2) 나노물질의 종류에 따른 유전독성반응성 비교 연구 ... 55
- 1) MWCNTs의 독성시험을 위한분산제 결정 및 최고 분산농도 결정 ... 55
- 2) 박테리아를 이용한 복귀돌연변이시험(High aspect ratio MWCNTs vs Low aspect ratio MWCNTs) - 예비시험 ... 58
- 3) 박테리아를 이용한 복귀돌연변이시험(High aspect ratio MWCNTs vs Low aspect ratio MWCNTs) - 본시험 ... 63
- 4) 포유류배양세포를 이용한 염색체이상시험(High aspect ratio MWCNTs vs Low aspect ratio MWCNTs) - 예비시험 ... 68
- 5) 포유류배양세포를 이용한 염색체이상시험(High aspect ratio MWCNTs vs Low aspect ratio MWCNTs) - 본시험 ... 75
- 6) High aspect ratio와 Low aspect ratio를 갖는 MWCNTs의 세포성장률차이에 있어서 Fe촉매에 대한 영향 평가 ... 83
- 7) 마우스 골수세포를 이용한 in vivo 소핵시험(High aspect ratio MWCNTs vs Low aspect ratio MWCNTs) ... 86
- (3) 유전자칩을 이용한 나노물질 독성시험법 기반 구축 ... 92
- 1)마이크로어레이 분석농도 및 시간결정 ... 92
- 2) 마이크로어레이 결과분석 ... 95
- 5. 고찰 및 결론 ... 112
- (1) 고찰 ... 112
- 1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성분석 ... 112
- 2) 나노물질의 종류에 따른 유전독성반응성 비교 연구 ... 113
- 3) 유전자칩을 이용한 나노물질 독성시험법 기반 구축 ... 114
- (2) 결론 ... 115
- 1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성분석 ... 115
- 2) 나노물질의 종류에 따른 유전독성반응성 비교 연구 ... 115
- 3) 유전자칩을 이용한 나노물질 독성시험법 기반 구축 ... 115
- 6. 연구목표 달성도 ... 117
- 7. 기대성과 및 활용방안 ... 117
- 8. 중요변경사항 ... 118
- 9. 참고문헌 ... 121
- 10. 참여연구원 명단 ... 124
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.