초록 ▼

☐ 연구개발 사업의 목적
암을 치료하는데 있어 가장 어려운 일은 암세포가 다른 장기로 전이되지 않도록하는 것이다. 암을 정복하기 위해서는 이러한 2차적인 암의 성질을 정복하여야 만이 가능할 것이다. Thymosin β4 (Tβ4)는 cytoskeleton을 구성하는 단백질의 하나인 액틴과 결합하여 액틴을 격리함으로써 cytoskeleton의 합성을 조절하는 단백질이다. 본 연구팀은 Tβ4가 과발현된 transgenic 마우스에서 Erk가 활성화되어 있고, 마우스 흑색종 세포를 이식한 결과 초기에는 암성장과 신생혈관이 대조군에

☐ 연구개발 사업의 목적
암을 치료하는데 있어 가장 어려운 일은 암세포가 다른 장기로 전이되지 않도록하는 것이다. 암을 정복하기 위해서는 이러한 2차적인 암의 성질을 정복하여야 만이 가능할 것이다. Thymosin β4 (Tβ4)는 cytoskeleton을 구성하는 단백질의 하나인 액틴과 결합하여 액틴을 격리함으로써 cytoskeleton의 합성을 조절하는 단백질이다. 본 연구팀은 Tβ4가 과발현된 transgenic 마우스에서 Erk가 활성화되어 있고, 마우스 흑색종 세포를 이식한 결과 초기에는 암성장과 신생혈관이 대조군에 비하여 증가하였으나, 이식후기에 대조군에 비하여 마우스의 생존율이 증가함을 발견하였다. 따라서 본 연구는 cytoskeleton의 합성조절 단백질인 Tβ4에 의한 암 주변 조직의 미세환경(microenvironment) 변화와 암 전이와의 상관관계를 규명함으로써 암 환자의 암전이 억제를 위한 새로운 전략을 제시하고자 함을 목적으로 하고 있다.

☐ 연구방법
Tβ4의 암전이 조절기작에 대한 연구는 다음과 같은 방법들을 사용하여 수행하였다.
1. Tβ4의 암 전이와의 상관관계를 규명하기 위하여 ① Wildtype과 Tβ4-transgenic 마우스에서 피하주사된 악성 흑색종의 성장을 측정하여 비교함. ② Wildtype과 Tβ4-transgenic 마우스에서 정맥주사된 악성 흑색종의 전이되어 폐에 보이는 흑점의 개수를 세어서 비교함. ③ Tβ4 단백질의 마우스 생존율에 대한 효능을 확인하기 위해, wildtype과 Tβ4-transgenic 마우스에서 고형암이 성장할 때 나타나는 마우스의 생존율을 비교함. ④ Wildtype 마우스에 악성 흑색종 B16F10 세포를 피하 이식한 후 Tβ4 단백질의 마우스 생존율에 대한 효능을 비교함. ⑤ 악성 흑색종 이식후 Tβ4 단백질 투여에 의한 마우스에서의 암성장을 대조군의 마우스와 비교하여 측정함. 종양의 성장은 장축과 단축을 측정후 다음의 식에 따라 계산하였음.
종양의 부피 = {(장축) x (단축)²}/2

2. Tβ4 단백질이 암세포이동에 미치는 영향을 확인하기 위하여 ① B16F10 세포가 배양접시에서 confluent하게 되도록 배양하고, tip을 이용하여 일정하게 scratch한 후, 1 μg/ml의 Tβ4 단백질을 처리하여 12시간이상 관찰하였음. ② B16F10 세포가 배양접시에서 70% 정도 confluent하게 되도록 배양하고, lentiviral shTβ4를 감염시켜 16시간 배양한다. tip을 이용하여 일정하게 scratch한 후, 대조군과 비교하여 12시간이상 관찰하였음.

3. Tβ4의 신호전달과정에 미치는 영향을 규명하기 위하여 ① B16F10 세포주를 Tβ4 단백질로 처리한 후 Erk의 활성화를 측정함. ②Wildtype 마우스와 Tβ4가 과발현된 transgenic 마우스의 각 조직별로 Erk의 활성화를 확인하기 위하여, western blot을 이용하여 Erk 인산화를 확인하여 비교함.
③ Tβ4 발현이 서로 다른 위암 세포주 SNU638 및 SNU668의 Erk 발현 정도를 비교함. ④ Erk 억제
제인 PD98059의 존재 유뮤에 따라 암세포 이동을 관찰함. ⑤ Tβ4 발현이 서로 다른 위암 세포주 SNU638 및 SNU668의 Wnt 신호전달 과정에 있어 GSK-3의 활성을 western blot으로 확인함. ⑥ Tβ4 단백질이 전사인자인 NF-kB를 활성화시킴을 확인함.

4. Tβ4 단백질에 의한 활성산소가 Erk 활성화와 암세포 이동에 미치는 영향 ① B16F10 세포가 배양접시에서 70% 정도 confluent하게 되도록 배양하고, tip을 이용하여 일정하게 scratch한 후, 생성되는 활성산소를 DCF-DA를 사용하여 유세포 분석기로 측정함. ② 활성산소 소거제인 N-acetylcysteine (NAC)의 존재 유‧뮤에 따라 암 세포의 Erk 인산화 정도를 비교하고, 암세포 이동을 관찰함. 세포이동을 비교하기 위하여 이동한 세포수를 계수하거나 이동한 면적비를 측정하였음.

5. Tβ4의 암성장과 암전이 및 조절을 매개하는 인자를 확인하기 위하여 ① 조건의 세포를 propidium iodide로 염색한 후 세포주기 양상을 유세포 분석기로 측정하였음. 아울러 세포사멸 정도도 비교하였음. ② 혈관내피세포 성장인자인 VEGF의 발현을 RT-PCR로 확인하였음. Tβ4에 의한 VEGF 발현 조절을 확인하기 위하여 Tβ4-shRNA를 이용하였음. ③ Tβ4의 MMP 발현에 대한 영향을 확인하기 위하여, Agilent사의 마이크로어레이를 이용하여 유전자들의 발현을 확인하였고, MMP 발현에 대한 결과를 그래프로 정리하였음. ④ 마우스 흑색종 세포를 투여된 마우스 혈장 중에 존재하는 염증성 사이토카인은 각각의 혈장에 대해 사이토카인 어레이를 수행하여 확인하였음.

☐ 연구결과
1. Wildtype과 비교할 때 Tβ4-transgenic 마우스에서 악성 흑색종의 성장과 전이가 증가한 반면, Tβ4-transgenic 마우스의 생존율은 증가하였다. 또한 Wildtype 마우스에 악성 흑색종 이식한 후 Tβ4단백질을 투여한 경우에도 마우스의 성장과 생존율이 모두 증가함을 확인하였다.
2. 마우스 흑색종 세포의 이동시에 Tβ4 발현이 증가하였으며, shTβ4를 이용하여 Tβ4를 억제하면 암세포의 이동이 억제되었다.
3. 마우스 흑색종 세포를 Tβ4 단백질로 처리하거나 Tβ4가 과발현된 마우스 조직 및 Tβ4의 발현 수준이 높은 세포에서 Erk가 활성화되어 있음을 확인하였으며, Erk 억제제인 PD98059에 의해 세포의 이동이 저해됨을 확인하였다. 또한 Tβ4는 Erk 의 활성화외에 Wnt 신호전달과정의 GSK-3와 NF-κB의 활성화도 조절함 규명하였다.
4. B16F10 세포층에 공간이 생겨 세포가 이동하는 경우 활성산소의 생성이 증가하는 것으로 나타났다. 이때 활성산소 소거제인 N-acetylcysteine (NAC)을 처리하면 Erk의 인산화가 억제되고 세포의 이동이 감소함을 확인하였다.
5. Tβ4는 어떠한 조건에서도 세포사멸을 억제하는 효과를 보이는 반면 세포주기에는 영향을 주지않는 것으로 확인되었다. Tβ4는 내재 조절물질 (endogenouse regulator)로서 VEGF의 발현을 조절하였다 Tβ4는 MMP4, MMP12, MMP17, MMP23, MMP25의 발현이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. Tβ4는 암성장 시기에 따라 IL-1류, IL-17, IL-23, IL27, M-CSF, MIP, SDF-1 등의 생성을 조절하는 것으로 나타났다.

Abstract ▼

It is challenging for tumor therapeutics not to spread from one part of the body to another via the bloodstream or across a body cavity. Tß4 is a regulatory protein to cytoskeleton synthesis by sequestering actin to isolate G-actin. My research team found metastasis and angiogenesis more increased t

It is challenging for tumor therapeutics not to spread from one part of the body to another via the bloodstream or across a body cavity. Tß4 is a regulatory protein to cytoskeleton synthesis by sequestering actin to isolate G-actin. My research team found metastasis and angiogenesis more increased than control group. Also Tß4 protein increase Erk activity and VEGF expression related to angiogenesis in metastasis, and then it found that ROS are related over expression of Tß4. The purpose of this study is to understand a function and a role of Tß4 on tumor cells and tumor cell's microenvironment. Here, we investigated the effect of Tβ4 on tumor microenvironment and metastasis by using Tß4-expressing transgenic mice and Tß4 protein. We will also contribute to find cancer mechanism and suppression strategy. The results obtained in this project were summarized below.

We investigated whether Tß4 affected tumor growth and lung metastasis. To examine the effect of Tß4 on tumor growth, we subcutaneously implanted B16F10 mouse melanoma cells into wildtype and Tß4-transgenic mice. Tumor growth in Tß4-transgenic mice was more rapid than that in wildtype mice. Furthermore, to examine the effect of Tß4 on lung metastasis, we injected B16F10 mouse melanoma cells into tail vein and then assessed lung metastasis by counting tumor colony. As shown in Fig. 5b and c, number of tumor colony was significantly increased in Tß4-transgenic mice as compared to that in wildtype mice. These findings suggest that hypoxic condition could be established by Tß4 gene overexpression and then lung metastasis could be enhanced by HIF-1α stabilization in Tß4-transgenic mice.

We determined the effect of Tß4 peptide on tumor cell migration. Tumor cell migration was enhanced by the treatment with Tß4 peptide. Given that cell density was increased by the treatment with Tß4 peptide, we treated B16F10 cells with mitomycin C that inhibited cell proliferation.
mitomycin C-treated tumor cell migration was also enhanced by the treatment with Tß4 peptide.
Decreased wound migration in cells infected with lentiviral shRNA of Tß4 was recovered by the addition of Tß4 peptide. Data indicate that tumor cell migration is dependent on Tß4 expression.

We also found that Erk phosphorylation was higher in SNU668 cells with a relatively higher level of Tß4 than that in SNU638 cells. When Tß4 expression in SNU668 cells was inhibited by Tß4-siRNA, Erk phosphorylation was decreased. In addition, the amount of phospho-Erk was increased by the treatment with Ac-SDKP in SNU638 cells. We examined whether Erk phosphorylation affects GSK-3 activity by the treatment of SNU668 cells with PD98059, a well known MEK inhibitor, that disrupts the activation of downstream Erk by preventing their phosphorylation. Erk phosphorylation was reduced by the treatment with PD98059. SNU668 cell migration was also inhibited by the treatment with PD98059, Erk inhibitor.

We also found that Erk phosphorylation was higher in SNU668 cells with a relatively higher level of Tß4 than that in SNU638 cells. When Tß4 expression in SNU668 cells was inhibited by Tß4-siRNA, Erk phosphorylation was decreased. In addition, the amount of phospho-Erk was increased by the treatment with Ac-SDKP in SNU638 cells. We examined whether Erk phosphorylation affects GSK-3 activity by the treatment of SNU668 cells with PD98059, a well-known MEK inhibitor, that disrupts the activation of downstream Erk by preventing their phosphorylation. Erk phosphorylation was reduced by the treatment with PD98059. SNU668 cell migration was also inhibited by the treatment with PD98059, Erk inhibitor.

We investigated whether GSK-3 activity is regulated by Tβ4 and it is associated with Tβ 4-mediated migration in gastric cancer cells. Various expression level of Tβ4 was observed in human gastric tumor tissues. Migration in gastric cancer cells, SNU638 and SNU668, was dependent on a relative expression level of Tβ4. Cell migration was higher in SNU668 with a higher expression level of Tβ4 than that in SNU638 with a lower Tβ4. Although the level of phosphorylated(p)-GSK-3α (inactive) was relatively higher, p-GSK-3β (inactive) was lower in SNU638 compared to those in SNU668 cells. NF-kB was also regulated by Tβ4.

Cell migration plays a role in many physiological and pathological processes. Reactive oxygen species (ROS) produced in mammalian cells infl uence intracellular signaling processes which in turn regulate various biological activities. Here, we investigated whether melanoma cell migration could be controlled by ROS production under normoxia condition. Cell migration was measured by wound healing assay after scratching confluent monolayer of B16F10 mouse melanoma cells. Cell migration was enhanced over 12 h after scratching cells. In addition, we found that ROS production was increased by scratching cells. Erk phosphorylation was also increased by scratching cells but it was decreased by the treatment with ROS scavengers, N-acetylcysteine (NAC). B16F10 cell migration was inhibited by the treatment with PD98059, Erk inhibitor or NAC, well-known ROS scavenger.

We investigated whether angiogenesis and tumor metastasis are dependent on hypoxia conditioning-induced Tß4 expression in B16F10 melanoma cells. Tß4 expression in B16F10 cells was increased by hypoxia conditioning in a time-dependent manner. When Tß4 expression in B16F10 cells was inhibited by the infection with small hairpin (sh) RNA of Tß4 cloned in lentiviral vector, the expression of VEGF isoform 165 and 121 in hypoxia were also reduced by the infection of lentiviral shRNA of Tß4 in B16F10 cells.

When we measured various gene expression in wildtype and Tβ4-transgenic macrophages using microarray from Agilent, the expression of various matrix metalloproteases such as MMP4, MMP12, MMP17, MMP23, MMP25 was increased by Tβ4. We also performed cytokine array to plasma sample from wildtype and Tβ4-transgenic mouse blood. It is dependent on Cytokine concentration was various in plasma depending on the time when wildtype and Tβ4-transgenic mice were stimulated with B16F10 cells.
Cytokines such as IL-1, IL-17, IL-23, IL27, M-CSF, MIP, and SDF-1 were variously alterated in plasma collected at day 1 and day 6.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• 연구개발사업 최종연구개발결과보고서 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• 1. 연구과제의 최종 연구개발 목표 ... 8
• 1.1. 연구개발의 필요성 ... 8
• 2. 연구과제의 연구대상 및 방법 ... 13
• 3. 연구과제의 연구개발결과 ... 15
• 3.1. Tβ4 단백질의 암전이의 상관관계 연구 ... 15
• 3.2. Tβ4 단백질이 암세포이동에 미치는 영향 ... 17
• 3.3. Tβ4의 신호전달과정에 미치는 영향 ... 18
• 3.4. Tβ4 단백질에 의한 활성산소가 Erk 활성화 및 암세포 이동에 미치는 영향 ... 22
• 3.5. Tβ4의 암성장과 암전이 및 조절을 매개하는 인자에 대한 연구 ... 24
• 4. 연구과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 28
• 4.1. Tβ4 단백질의 암전이의 상관관계 연구 ... 28
• 4.2. Tβ4 단백질이 암세포이동에 미치는 영향 ... 28
• 4.3. Tβ4의 신호전달과정에 미치는 영향 ... 28
• 4.4. Tβ4 단백질에 의한 활성산소가 Erk 활성화 및 암세포 이동에 미치는 영향 ... 29
• 4.5. Tβ4의 암성장과 암전이 및 조절을 매개하는 인자에 대한 연구 ... 29
• 5. 연구과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 31
• (1) 연구성과 총괄 ... 31
• (2) 연구성과 상세내역 ... 32
• (3) 연구개발과제의 목표달성도 ... 43
• 6. 연구과제의 활용계획 ... 44
• (1) 연구종료 3년까지 예상 연구성과 ... 44
• (2) 연구성과의 활용계획 ... 44
• (3) 추가연구의 필요성 ... 45
• 7. 참고문헌 ... 45