[국가R&D연구보고서]설치류의 자연 골관절염 모델에서 관절강 서방형 sulforaphane 주사의 연골 보호 효과와 기전 The efficacy of slow release intra-articular form of sulforaphane on the protection of cartilage in rodent model of natural osteoarthritis원문보기
보고서 정보
주관연구기관
한림대학교 산학협력단 HalLym University
보고서유형
최종보고서
발행국가
대한민국
언어
한국어
발행년월
2012-12
과제시작연도
2011
주관부처
교육과학기술부 Ministry of Education and Science Technology(MEST)
연구의 목적 및 내용 본 연구의 목표는 1) 인간의 자연 발생 골관절염에 근접한 설치류의 골관절염 모델을 확립하고 2) 천연물 골관절염 치료제인 sulforaphane(SFN)의 효능을 검정하고 작용 기전을 규명하는 것임. 현재 골관절염의 동물 모델은 중동물을 주로 이용함으로 비용과 동물 사육 시설의 제한으로 한계가 있음. 쉽게 사육할 수 있으며 사육 공간의 제약이 크지 않은 설치류를 이용한 동물 모델이 실용성의 측면에서 절실함. 또한 화학물질의 주입이나 인위적인 인대 손상 등의 방법이 아닌 인간의 자연 발생적
연구의 목적 및 내용 본 연구의 목표는 1) 인간의 자연 발생 골관절염에 근접한 설치류의 골관절염 모델을 확립하고 2) 천연물 골관절염 치료제인 sulforaphane(SFN)의 효능을 검정하고 작용 기전을 규명하는 것임. 현재 골관절염의 동물 모델은 중동물을 주로 이용함으로 비용과 동물 사육 시설의 제한으로 한계가 있음. 쉽게 사육할 수 있으며 사육 공간의 제약이 크지 않은 설치류를 이용한 동물 모델이 실용성의 측면에서 절실함. 또한 화학물질의 주입이나 인위적인 인대 손상 등의 방법이 아닌 인간의 자연 발생적인 골관절염을 재현하는 모델이 필요한데 골관절염의 동물 모델이 적절하지 않다면 어떠한 치료제가 개발되어도 동물 실험 검정을 할 수 없기 때문임. 한편 만성 질환인 골관절염의 치료제는 낮은 독성/효과 비율이 필수적인데 천연물에 포함되어 있는 저독성 물질을 관절강내 서방형 제제로 개발하여 골관절염 모델에서 효능을 검정함으로 골관절염의 치료제 개발과 함께 약효 검정 시스템까지 구축할 수 있음. 연구결과 (1) 비만/운동 protocol을 이용한 자연 발생적인 설치류 동물 골관절염 모델의 확립 비만 동물에서 변형된 treadmill을 이용한 obligatory bipedalism 유도 시 Mankin, Glasson grade 모두 control-exercise, obese-exercise 군에서 운동 시작 8주 후부터 관절의 손상이 관찰되기 시작하고 운동이 진행됨에 따라 grade 가 높아짐을 관찰함. control-bipedal group 과 obese-bipedal group에서 연골 세포 고사가 현저히 증가함. (2) Sulforaphane 함유 고분자 지지체 합성 조성 : Inner-water phase :Suforaphane (1mg/8.0ml), Oil phase :PLGA/Methylene chloride (10%) 20ml, Outer-water phase PVA (3%) 400ml 방출 거동 관찰 시 30일 동안 서서히 방출됨을 확인함. 이를 바탕으로 in vitro 실험시 필요한 SFN-PLGA의 양을 결정함. (3) SFN이 골관절염에 보이는 효능 검정(in vitro) 1) SFN은 사람 골관절염 연골 세포에서 IL-1 과 TNF-α에 의해 유도되는 catabolic mediator 인 prostaglaindin E2(PGE2), MMP-1,3,13의 분비를 농도 의존적으로 억제함. 2) SFN은 사람 골관절염 연골 세포에서 IL-1 과 TNF-α에 의해 유도되는 catabolic mediator 인 nitric oxide(NO)의 분비를 농도 의존적으로 억제함. 또한 배양 연골 세포에서 IL-1 과 TNF-α에 의해 유도되는 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 발현을 mRNA, protein level에서 모두 현저히 감소시킴. 3)이러한 SFN의 anti-catabolic activity 는 IKK, IkB phosphorylation 을 경유하는 NF-kB system 의 조절에 의해 이루어짐 4) 또한 luciferase assay, Chip assay를 통해 SFN이 NF-kB activation 을 억제하고 NF-kB의 COX-2, iNOS promoter binding 을 억제함을 보임. 5) SFN은 explant 로 조직 배양된 연골에서도 catabolic stimuli에 의해 유도되는 연골 분해 효과를 상쇄시킴. (4)SFN이 골관절염 동물 모델에 보이는 효능 검정(in vivo) rat의 전방 십자인대 및 반월상연골판을 절제하여 골관절염 모델을 제작하고, 절제 부위에 SFN-PLGA와 Fibrin을 처리한 후, 수술 8주 후에 희생하여 분석함. Macroscopic observation, safranin-O staining, OARSI score의 결과 모두에서 Fibrin만 처리된 그룹과 비교하여 SFN-PLGA가 처리된 그룹에서 연골보호 효과가 우수한 것으로 확인됨. 연구결과의 활용계획 본 연구에서 개발된 동물 모델은 골관절염 치료제 검정에 폭넓게 사용할 수 있음. 또한 가장 흔히 이용되는 C57BL6 mouse 종을 사용하였기 때문에 knock-out model을 쉽게 제작할 수 있어 특정 유전자나 관절염 병인 후보 물질의 검정도 가능함. 본 연구의 의의는 1) 골관절염의 약물 효능 검정에 바로 적용할 수 있는 실용적인 동물 모델의 개발과 2) 천연물 유래 성분인 sulforaphane의 관절 연골 보호 효과 규명으로 새로운 천연물 약제 개발의 단초를 제시했다는 점임.
Abstract▼
Purpose& contents 1) To develop a rodent model closely mimicking natural osteoarthritis(OA) in human 2) To examine the effectiveness of sulforaphane(SFN), a naturally occurring compound on the development and progression of rodent OA model and to elucidate its mechanism of action Currently,
Purpose& contents 1) To develop a rodent model closely mimicking natural osteoarthritis(OA) in human 2) To examine the effectiveness of sulforaphane(SFN), a naturally occurring compound on the development and progression of rodent OA model and to elucidate its mechanism of action Currently, OA models employ animals larger than rabbit, which poses significant limitation due to cost and breeding facility. Practical and easily applicable rodent model which replicate natural OA of human is needed. Making use of diet and exercise induced OA model, we plan to establish a novel rodent OA model in this study. In addition, by developing slow release SFN intra-articular injection form, we plan to observe its effectiveness on the progression of OA. The pertinent mechanism of cartilage protection conferred by SFN is also investigated. Result (1) Establishment of natural rodent OA model employing high fat diet/exercise 1)Mouse were divided into 4 groups : control,(normal diet/no exercise), group 1(high fat diet/no exercise), group 2(normal diet, bipedal exercise), group 3(high fat diet/bipedal exercise). 8 weeks after exercise, animals on bipedal exercise showed significant deterioration in cartilage, which progressed as the duration of exercise increased. (2) Development of slow release intra-articular SFN delivery system 1) intra-articular delivery system using high molecular weight scaffold and porous bead was produced, and in vitro release kinetics as well as the inhibitory effect on in-vitro inflammation was observed. (3) Elucidation of cartilage protecting effect of SFN (in vitro) 1) SFN was found to reduce PGE2, MMP-1,3,13 production as well as COX-2, and mPGES expression induced with IL-1 and TNF-alpha. 2) SFN was found to reduce NO production as well as iNOS expression induced with IL-1 and TNF-alpha. 3) The mechanism of regulation of inflammation by SFN was found to involve regulation of NF-kB system. 4) SFN was found to reduce proteoglycan and type II collagen release into the media in chondrocyte explant cultures stimulated with IL-1 and TNF-alpha. (4) Examination of the effectiveness of slow-release SFN in rat OA model SFN was found to protect cartilage destruction in a rat meniscus dissection and ACL transection models. Expected Contribution 1) Academic aspect This study will lead to a novel and practical rodent model of natural OA. With this animal model, animal study of OA therapeutics would be much facilitated. In addition, discovery of less toxic and effective agent for cartilage protection will hasten the development of novel therapeutics in OA. 2) Industrial aspect This study will provide the basis of the development of novel OA treatment, which can lead to the creation of huge pharmaceutical market for this intractable and important disease. 3) Educational aspect Training in biology and pre-clinical experimentation would lead to many researchers specialized in both biological and clinical science.
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