[보고서]분자반응 조절을 통한 면역력개선 천연소재 개발

분자반응 조절을 통한 면역력개선 천연소재 개발
Investigation of natural material on immunity improvement by regulation of molecular reaction 원문보기

보고서 정보
주관연구기관	국립농업과학원 National Institute of Agricultural Sciences
보고서유형	최종보고서
발행국가	대한민국
언어	한국어
발행년월	2013-02
과제시작연도	2012
주관부처	농촌진흥청 Rural Development Administration(RDA)
등록번호	TRKO201300013882
과제고유번호	1395025549
사업명	농식품자원연구
DB 구축일자	2013-07-29
DOI	https://doi.org/10.23000/TRKO201300013882

초록 ▼

Ⅲ. 연구개발의 내용 및 범위
제1세부연구 : 국내 농식품함유 기능성물질 면역조절 평가연구
1. 국내 농식품 소재 면역활성 조절 우수시료 선발
가. 세포독성 평가
나. 면역세포(B 림프구) 활성 평가
다. 면역조절 사이토카인 생성 평가
2. 선발된 면역 조절 우수소재 분획물의 ex v ivo 면역활성 평가
가. 자연살해세포 활성 평가
나. 마우스 primary B림프구 표면항원 활성 평가
다. 마우스 primary B림프구 증식활성 평가
3. 동물모델을 이용한 면역활성 우소소재 참취 분획물의 in v iv o 활성평가
가. 체중, 식이섭취량, 장기무게 변화 평가
나. 시료 경구투여에 따른 마우스 B림프구 표면항원 활성평가
다. 시료 경구투여에 따른 마우스 B림프구 생성 사이토카인 생성평가
제2세부연구 : 국내 농식품 함유 면역증강물질 특성분석 및 생산공정 개발
1. 국내 농식품 함유 면역증강 유효물질 탐색
가. 산채 추출물 및 용매분획물 조제
나. Endotoxin 측정( LPS 오염 측정)
2. 국내 농식품 함유 면역증강 유효물질 탐색(II) 및 물질분리
가. 항산화 활성 평가
나. 면역증강물질 분리정제 및 구조해석(참취 chloroform 분획물)
다. 항산화활성 물질 분리정제 및 구조해석(방아풀 ethyl acetate 분획물)
3. 면역증강 유효물질의 특성평가 및 구조해석
가. 산채의 페놀 및 플라보노이드 함량
나. 면역 활성 물질의 구조해석(참취)
다. 항산화활성 물질의 구조해석(방아풀)
라. 유효물질 대량생산 공정법 확립
제1협동연구 : 국내자생원료의 면역활성 효과 평가
1.국내자생원료 물질의 면역세포 조절과 관련된 기능성 소재 확보
가. 면역세포에 미치는 영향 분석 및 규명 (in v itro)
나. 면역세포 조절과 관련된 기능성 소재 확보
2. 기능성 소재에 의한 면역세포 조절인자 분석 및 규명
가. 기능성 소재에 의한 면역세포의 유전자 발현 분석
나. 기능성 소재에 의한 면역세포의 단백질 발현 분석
3. 국내자생원료 물질의 천식조절과 관련된 기능성 소재 확보
가. O V A 유도 천식모델의 개발
나. O V A 유도 천식의 억제 효능을 갖는 기능성 소재 확보 ( in vivo)
제2협동연구 : 면역부작용 및 allergy 반응 저감화를 위한 전이유전자형질 전환체 개발
1. 인간화 당사슬로 최적화된 감자 식물체 개발
가. R NA i를 이용한 β( 1,2)-xylose, 및 α-(1,3)- fucose 제거 식물체 개발
나. 목표 당단백질 당사슬 분석 조건확립
2. 식물 당단백질의 당사슬을 절단할 수 있는 PNGase 효소 발굴
가. 후보 유전자 선발 및 곰팡이, 효모 PNGase 유전자 클로닝 및 스크리닝
나. PNGase 절단효소 발굴, 활성비교 평가
3. 인간화 당사슬을 가진 감자에서의 목표 단백질 생산 체계 확립
가. 인간화 당단백질의 효율적 생산, 정제 시스템
나. 당쇄 구조 변형된 fetuin 단백질의 정제 및 당쇄구조 분석
다. R NA i-knock dow n된 선발 개체 X T -16과 대장암 항체관련 유전자 과발현 형질전환 담배와의 교배, 선발
제3협동연구 : In vitro 및 in vivo 동물실험을 통한 항체 synergistic effect 규명
1. in vitro 동물세포 A D CC 실험 구축
가. A D CC 실험 조건 확립
나. 대장암 유발 동물 모델 확립
다. 동물 항암·항체를 이용한 동물세포 실험 조건 확립
2. 동물모델 내 각 항암;항체의 개별 활성 분석
가. Ganglioside 처리를 통한 항염 반응 확인
나. 병리학적 항염반응 확인
다. Gangliosides 조절을 통한 세포분화 역할 분석완료
3. 식물복합단일항체 항암 synergy효과 확인
가. 식물 소재 항체의 항암효과 확인( In v itro)
나. 참취 추출물의 농도별 항암synergy 효과 확인완료
제4협동연구 : 복합단일항체 면역치료제의 대량생산 기술 개발
1. 두 mA b의 유전인자 발현 형질전환 식물체 확립
가. mA b CO17-1A 와 mA b BR 55 유전 인자를 식물발현벡터에 클로닝
나. A grobacterium을 이용한 각 항체( full size mA b CO 17-1A 와 full sizemA bBR 55) 형질전환 식물체 확보
다. 형질전환 식물의 항체 발현량 측정
2. 식물 교배와 mAb CO17-1A와 mAb BR55 (link된) 두 항체의 유전인자를 갖는 식물 확립
가. 식물 교배 및 두 항체 (mA b CO 17-1A /mA b BR 55) 발현 식물체 확보
나. 두 항체 유전인자 유무 확인
다. 각 항체 H C과 LC의 발현 확인
라. 두 항체의 항암활성 분석
3. 동일 식물체 내 두 항체 대량생산
가.Protein A 를 이용한 항체 정제
나. 식물(잎) 정제 항체의 암세포 인식 활성 측정
다. F c 활성 측정( F c receptors와 항체 F c의 상호작용 확인)

Abstract ▼

Ⅱ. Backgrounds and purposes
Recently, people are stepping up their efforts to prevent a disease and keep optimum health. Especially, the modulation of the immune responses to alleviate the diseases has been of interest for many years. Currently there is considerable scientific and commercial interest in the continuing discovery of immunemodulatory agents as a new anticancer measure from natural product sources. Advances in immunology, molecular biology, and plant biotechnology have changed the paradigm of plant as a food source to so called ' plant bioreactor' to produce valuable recombinant proteins, such as therapeutic or diagnostic monoclonal antibodies. Plants as bioreactors for the production of therapeutic proteins have several advantages which include the lack of animal pathogenic contaminants, low cost of production, and ease of agricultural scale-up compared to other currently available systems. Thus, plants are considered to be a potential alternative way to compete with conventional systems such as bacteria, yeast, or insect and mammalian cell culture. Recent demand of anti-cancer antibodies for therapeutic or diagnostic purposes is increasing. In 2015, antibody market will increase up to more than US$25 billion. Thus, transgenic plant production systems which enable high production levels of therapeutic antibodies are very attractive to pharmaceutical companies who want to produce antibodies in demand. In this study, we aimed to explore immunomodulatory regent from natural sources and developed transgenic plant system for production of both anti-colorectal cancer monoclonal antibody and anti-breast cancer monoclonal antibody in a single plant. Moreover, we tried to evaluate synergistic effect between natural sources and plant-derived antibody for commercialization.
Ⅲ. Results and discussion
- To explore the immunostimulatory activities and its molecular action mechanism from Korean wild edible vegetables, we evaluate the immunomodulatory effects and production of cytokine by Korean wild edible vegetables (I sodon japonicus, Z anthoxylum schinifolium, Aster yomena and Aster scaber). As a results, the Aster scaber was selected the excellent sources of immune response. Continuously, we aimed to demonstrate the immunomodulatory effects of Aster scaber on specific immune responses mediated by macrophages and B cell and in vivo experiment. Aster scaber increased the surface levels of co-stimulatory molecules (CD19, CD21, CD161 and CD69) and the expression of cytokine such as TNF-alpha, IFN-gamma and IL-4. Therefore, these data suggest that Aster scaber may preferentially participate in regulating lymphocyte-mediated innate and adaptive responses and that some of these may deserve in anti-tumor and anti-microbial effects.

목차 Contents

표지 ... 1
제출문 ... 2
요약문 ... 4
SUMMARY ... 10
목차 ... 13
제 1 장 서 론 ... 14
제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 17
제1절 국내 • 외 연구 현황 ... 17
제2절 필요 연구 분야 ... 19
제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 20
제1절 국내 농식품 함유 기능성물질 면역조절 평가 연구(1세부연구) ... 20
제2절 국내 농식품 함유 면역증강물질 특성분석 및 생산공정법 개발(2세부연구) ... 33
제3절 국내자생원료의 면역활성 효과 평가(1협동연구) ... 46
제4절 면역부작용 및 allergy 반응 저감화를 위한 전이유전자형질 전환체 개발(2협동연구) ... 56
제5절 I n vitro 및 in vivo 동물실험을 통한 항체 synergistic effect 규명(3협동연구) ... 70
제6절 복합단일항체 면역치료제의 대량생산 기술 개발 (4협동연구) ... 86
제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 105
1절 목표대비 대외 달성도 ... 105
2절 정량적 성과 ... 107
제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 111
제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 112
제 7 장 기타 중요 변동사항 ... 113
제 8 장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비현황 ... 114
제 9 장 참고문헌 ... 115

표/그림 (119)

표 Fig. 1. The cell viability effect of four kinds of Korean wild edible vegetables on Raw 264.7 cell.
표 Fig. 2. The cell proliferation effect of Korean wild edible vegetables on mouse B lymphocyte.
표 Fig. 3. The cell proliferation effect of Korean wild edible vegetables on mouse peritoneal macrophage.
표 Fig. 4. The effect of Korean wild edible vegetables on ex-vivo cytokine production from mouse B lymphocyte
표 Fig. 5. The effect of Korean wild edible vegetables on ex-vivo cytokine production from mouse peritoneal macrophage
표 Fig. 6. The effect of edible vegetables extract on the ex-vivo NK cell activity from mouse splenocyte
표 Fig. 7. Comparing the frequency of B lymphocyte surface marker phenotype by edible vegetables extract treatment
표 Fig. 8. The effect of mouse B lymphocyte proliferation by edible vegetables extract.
$Fig. 9. The effect of Korean wild edible vegetables various fractions on cytokine production upon LPS stimulation$ 표 Fig. 9. The effect of Korean wild edible vegetables various fractions on cytokine production upon LPS stimulation
표 Fig. 10. Quatitative mRNA expression of related cell progrmaing death gene on A549 cacncer cell (Bax, Bcl-2) treated with wild edible vegetable extracts
표 Fig. 11. 참취 분획물 경구투여에 따른 마우스 체중 변화
표 Fig. 12. 참취 분획물 경구투여에 따른 마우스 사료섭취량 분석
표 Fig. 13. Comparing the frequency of natural killer cell surface marker phenotype by Aster scaber treatment in mice.
표 Fig. 14. Comparing the frequency of B lymphocyte surface marker phenotype by Aster scaber treatment in mice
표 Fig. 15. The cytokine production by Aster scaber treatment in mice.
표 Fig. 16. Chromatogram of the chloroform extracts derived from the Aster scaber
$Fig. 17. LC and Mass chromatogram of the sub-fraction derived from the Isodon japonicus$ 표 Fig. 17. LC and Mass chromatogram of the sub-fraction derived from the Isodon japonicus
표 Fig. 18. The structure of the butein is confirmed by 1H and 13C NMR spectral data
표 Fig. 19. The cytotoxicity of of crude extracts from korean wild edible vegetables
표 Fig. 20. Lymphocytes were stimulated with anti-CD3/28 Abs in the presence of ethanol extracts for 18 hr.
표 Fig. 21. Lymphocytes were stimulated with PMA/Ionomycine in the presence of ethanol extracts and GolgiStop® for 6 hr
표 Fig. 22. Lymphocytes were labeled with CFSE with 0.5 mM and then stimulated with anti-CD3/28 Abs in the presence of 70% ethanol- extracts from 4 different Korean wild edible vegetables for 3 days
표 Fig. 23. Flow cytometric analysis of CD69 (A), CD44 (B), and CD25 (C, top and bottom) expression by mouse lymph node T cells that were stimulated for 18 hrs with anti-CD3 (5 ug/mL)/CD28 (2 ug/mL) Abs in the presence or absence of above extracts.
$Fig. 24. Effect of sub-fraction of ethanol extracts on T cells proliferation upon TCR stimulation.$ 표 Fig. 24. Effect of sub-fraction of ethanol extracts on T cells proliferation upon TCR stimulation.
표 Fig. 25. microRNA profile analysis upon stimulation with the ethanol-extract of “Kalimeris yomena ”with 4 ug/ml for 18 hrs.
표 Fig. 26. Schematic diagram of murine OVA-induced asthma model and strategy of administration of ethanol extracts from Korean wild edible vegetables.
표 Fig. 27. Ethanol extract of Aster yomena decreases bronchoalveolar lavage (BAL) cells.
표 Fig. 28. A differential cell count was performed on Cytospin (Thermo Shandon, Pittsburgh, PA) by Wright - Giemsa staining.
표 Fig. 29. Ethanol extract of Aster yomena decreases IL-13 producing CD4+ T cell in BAL cells shown by flow cytometry (A) after stimulation with PMA/ionomycin for 4 hr in the presence of Golgiplug. Difference between the PBS and Kalimeris yomena treated groups were analyzed by the unpaired student t test (B).
표 Fig. 30. Ethanol extract of Aster yomena decreases IL-4, IL-13, and IL-17 in bronchoalveolar lavage (BAL) fluids.
표 Fig. 31. The serum OVA-specific IgE levels by ethanol extracts from Korean wild edible vegetable in OVA-induced asthma model.
표 Fig. 32. Pulmonary histologic analysis by the recruitment of leukocytes and mucos production from mice treated with PBS or ethanol extracts.
표 Fig. 33. Analysis of airway hypersensitivity to methacholine (Mch).
표 Fig. 34. 형질전환 β(1,2)xylT RNAi 식물체의 RT-PCR 선별과 western 선별 결과
표 Fig. 35. 선별된 형질전환 β(1,2)xylT RNAi 식물체의 당쇄 구조 분석
표 Fig. 36. XT two domain regions Ppc and COG4421 conjugation.
표 Fig. 37. Selection of pHGXT III by restriction enzyme digestion
표 Fig. 38. 형질전환 Human β1,4-galactosyl transferase유전자가 발현되는 식물체의 PCR 선별과 Northern 분석
표 Fig. 39. 형질전환 Human 2,3-sialyltransferase 유전자가 발현되는 식물체 PCR 선별과 Northern 분석
표 Fig. 40. 당사슬 절단 효소의 종류 및 특이성
표 Fig. 41. 식물 유래 당사슬 분석 시스템 확립
표 Fig. 42. HPLC 방법을 이용한 RNase B와 HRP의 N -당사슬의 프로파일 분석.
표 Fig. 43. Maldi-TOF 장비를 이용한 horseradish peroxidase의 N-당사슬의 프로파일 분석.
표 Fig. 44. DNA sequencer 방법을 이용한 horseradish peroxidase의 N-당사슬의 프로파일 분석.
표 Fig. 45. 여러 RNAi 벡터를 사용한 담배에서 일시 발현된 단백질의 당사슬 분석
표 Fig. 46. 담배에서 일시 발현된 인간 단백질 페투인의 당사슬 구조분석
표 그Fig. 47. PNGase의 N-당사슬 절단 특성 및 활성.
표 Fig. 48. 인공교배 후의 자방 사진
표 Fig. 49. 종자 수확 당시의 자방 상태
표 Fig. 50. 수확 종자의 발아력 시험 (대조구 종자)
표 Fig. 51. 종자의 외형적 모습 비교
표 Fig. 52. 각각의 형질전환 담배의 인공교배하여 얻은 종자의 카나마이신 저항성 시험
표 Fig. 53. 인간 대장암세포(SW948) xenografting 을 통한 쥐의 암유발 모델
표 Fig. 54. BALB/c Nude 쥐의 암세포 조직검사(Immunohistochemistry)를 통한 각각의 식물항체 활성 실험 계획도
표 Fig. 55. 생존율이 감소한 SW620 대장암 세포
표 Fig. 56. HPTLC 결과
표 Fig. 57. 면역형광염색 결과
표 Fig. 58. EpCAM mAb에 의한 SW620 대장암 세포의 apoptotic cell death (TUNEL)
표 Fig. 59. EpCAM mAb에 의한 SW620 대장암 세포 내의 apoptotic proteins 발현양상
표 Fig. 60. EpCAM mAb의 SW620 종양의 성장 억제 효과.
표 Fig. 61. ganglioside 처리에 의한 세포 생존률 확인
표 Fig. 62. ganglioside 처리에 의한 apoptotic cell death 확인
표 Fig. 63. pEGFP-C2 Vector ST8Sia5 Gene 삽입 모식도
표 Fig. 64. RT-PCR을 통한 ST8Sia5 gene 발현 확인
표 Fig. 65. ST8Sia5 gene이 삽입된 생쥐 배아 줄기세포에서 Ganglioside GQ1b의 발현확인
표 Fig. 66. ST8Sia5 gene이 삽입된 생쥐 배아 줄기세포로부터 배아체 형성 확인
표 Fig. 67. 배아체 형성과정에서 GQ1b가 발현하는 생쥐 배아 줄기세포의 배아체 수 확인
표 Fig. 68. 부착 후 4일간 배양시 nestin의 발현
표 Fig. 69. 부착 후 4일간 배양시 GFAP의 발현
표 Fig. 70. 부착 후 7일간 배양시 MAP-2의 발현
표 Fig. 71. Normal 생쥐 배아 줄기세포에서 ERK1/2의 인산화 확인
표 Fig. 72. GQ1b 발현 생쥐 배아 줄기세포에서 ERK1/2의 인산화 확인
표 Fig. 73. Hesperidin과 luteolin의 세포독성 확인
표 Fig.74. Hesperidin과 luteolin에 염증반응 억제 효과 확인
표 Fig. 75. luteolin에 염증반응 억제효과에서 COX-2 mRNA 및 단백질 확인
표 Fig. 76. luteolin에 염증반응 억제효과에서 TNF-α mRNA 및 단백질 확인
표 Fig. 77. luteolin에 염증반응 억제효과에서 NF-κB p50 및 p65 mRNA 및 단백질 확인
표 Fig. 78. luteolin에 염증반응 억제효과에서 iNOS mRNA 및 단백질 확인
표 Fig. 79. luteolin에 염증반응 억제효과에서 3가지 MAP kinase의 인산화 확인
표 Fig. 80. HPTLC에서 luteolin의 염증반응억제 효과 시 발현하는 ganglioside 확인
표 Fig. 81. 면역 형광 염색법에서 luteolin의 염증 반응 억제 효과 시 발현하는 ganglioside 확인
표 Fig. 82. 동물소재단일항체와 식물소재단일항체의 세포학적 발현을 면역형광염색법으로 확인
표 Fig. 83 SW620대장암세포에서 식물소재단일항체의 증식억제 효과
표 Fig. 84. SW620대장암세포의 세포사 유도에서 식물소재단일항체의 효과 확인
표 Fig. 85 식물소재단일항체와 대식세포로 처리된 대장암세포에서 세포사관련 gangliosides의 발현양상 확인
표 Fig. 31. SW620대장암세포의 증식에서 Aster scaber추출물의 농도별 시너지 효과확인
표 Fig. 86. SW620대장암세포에 식물항암항체 처리 후 참취추출물의 항암시너지 효과 확인
표 Fig. 87. 대장암세포와 대식세포 공동배양에서 참취추출물의 항암시너지 효과 확인
표 Fig. 88. 대장암세포와 대식세포의 공동배양에서 식물항암항체의 항암효과와 참취추출물의 항암시너지 효과 확인
표 Fig. 92. 식물발현벡터의 T-DNA region 구조
표 Fig. 93. 복합 단일 항체 발현 모식도
표 Fig. 94. 동물실험을 통해 항암 • 항체의 half-life를 확인하기 위해 GFP 및 RFP를 fusion시켜 형질전환체 확립 모식도
표 Fig. 95. 복합단일항체 발현하는 형질전환 식물 확립 모식도
표 Fig. 96. 식물 교배에 의한 한 식물에서 복합 단일항체의 효율적 생산 system 구축
표 Fig. 97. 형질전환 식물체에서 두 mAb (CO17-1A와 BR55) 단백질 유전자를 PCR을 통해 확인한 결과
표 Fig. 98. 형질전환 식물에서의 두 mAb (CO17-1A와 BR55) 단백질 발현.
표 Fig. 99. T-easy 벡터에 mAb CO17-1A 복합 단백질 유전자 Cloning.
표 Fig. 100. T-easy 벡터에 mAb BR55 복합 단백질 유전자 Cloning
표 Fig. 101. 식물 교배에 의한 한 식물에서 복합 단일항체의 효율적 생산 system 구축
표 Fig. 102. mAb BR55 유전인자를 갖는 식물발현벡터 제작
표 Fig. 103. 복합 단일항체를 발현하는 형질전환 식물체의 생산 및 기내배양
표 Fig. 104. plant growth camber에서 배양 중인 형질전환 식물체
표 Fig.105. 형질전환된 식물에서 mAb BR55 항체 발현 확인
표 Fig. 106. mAb BR55을 ELISA 실험을 통해 얻은 결과
표 Fig. 107. 항체 (BR55)의 FC 부분과 FC receptor 간의 interaction 확인
표 Fig. 108. T-easy 벡터에 mAb CO17-1A 복합 단백질 유전자 Cloning.
표 Fig. 108. T-easy 벡터에 mAb CO17-1A 복합 단백질 유전자 Cloning.
표 Fig. 109. T-easy 벡터에 mAb BR55 복합 단백질 유전자 Cloning
표 Fig. 109. T-easy 벡터에 mAb BR55 복합 단백질 유전자 Cloning
표 Fig. 110. 식물발현벡터 복합단일항체 (mAb CO17-1A-VL-HC, mAb BR55-VL-HC) cloning
표 Fig. 111. 식물발현벡터에 복합단일항체 (mAb CO17-1A-VL-HC-K, mAb BR55-VL HC-K) cloning
표 Fig. 112. pBI121 vector에 mAb BR55 Linker with KDEL과 mAb BR55 Linker without KDEL 항체 유전자 확인
표 Fig. 113. 식물 형질전환을 위한 Agro-bacterium 에 mAb BR55 Linker 유전자 삽입 후 유전자 확인
표 Fig. 114. 복합단일항체를 발현하는 식물체를 대량생산하기 위한 연구진행방법
표 Fig. 115. mAb BR55를 발현하는 식물체와 mAb CO17-1A를 발현하는 식물체를 타가수분을 통해 seed를 얻고, seedbank를 구축함
표 Fig. 116. 구축된 seedbank의 씨앗을 in vitro culture를 통해 유식물(BR55W × CO17-1A W), (BR55W/O × CO17-1AW)을 생산함
표 Fig. 117. 복합단일항체를 발현하는 식물체의 교잡종 F1을 확보하기위한 in vivo 식물체를 대량재배함
표 Fig. 118. 생산된 식물체내에 복합단일항체 유전자가 존재하는지 확인하기위해식물체에서 Genomic DNA를 추출하여 PCR analysis를 통해 유전자 삽입 확인
표 Fig. 119. 생산된 복합단일항체를 발현하는 식물체에서 항체발현을 확인함

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