초록 ▼

III. 연구개발의 내용 및 범위
축산물의 생산․공정단계별 병원균 및 항생제 내성균의 분포 조사를 위하여 일반 축산 농가와 무항생제 축산농가의 항생제 내성균 분포 비교와 도축장 및 축산물 가공장의 각 단계별 주요 항생제 내성균 분포 조사를 수행하였다. 또한, 주요 내성균의 전파경로를 분석하고 유전학적 특성 및 내성기전을 파악하고, 축산농가와 축산물간의 내성균 전파와 경로를 분석하기 위하여 가축 분리균과 축산식품 유래 내성균의 분자․역학적 특성을 조사하였으며, 동물유래 내성균과 채소류 및 생산 환경에서 분리된 내성균의 분자․역학

III. 연구개발의 내용 및 범위
축산물의 생산․공정단계별 병원균 및 항생제 내성균의 분포 조사를 위하여 일반 축산 농가와 무항생제 축산농가의 항생제 내성균 분포 비교와 도축장 및 축산물 가공장의 각 단계별 주요 항생제 내성균 분포 조사를 수행하였다. 또한, 주요 내성균의 전파경로를 분석하고 유전학적 특성 및 내성기전을 파악하고, 축산농가와 축산물간의 내성균 전파와 경로를 분석하기 위하여 가축 분리균과 축산식품 유래 내성균의 분자․역학적 특성을 조사하였으며, 동물유래 내성균과 채소류 및 생산 환경에서 분리된 내성균의 분자․역학적 특성을 비교하였다.
관행농가 농산물 및 환경(액비 등)과 자연순환농가, 유기농가 농산물 및 환경(액비 등) 검체에서 식중독균(Salmonella spp., Escherichia coli O-157, Staphylococcus aureus 등) 및 지표균(Escherichia coli, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis)을 분리하였다.
분리된 미생물들은 Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI) Guidelines 기준에 따라 Disk diffusion법 및 Minimal Inhibitory Concentration (MIC)법으로 시험하여 축산용 주요 항생제인 tetracycline계, sulfonamide계, β-lactam계(penicillin계) 및
aminoglycoside계, marcrolide계 및 quinolone계 내성을 갖는 균주를 선별하고 PCR에 의한 항생제 계열별 내성 유전자를 검출하고 내성균의 유전적 특성을 파악하였다. 또한, 농가별 농산물 및 농가 주변환경 유래 항생제 내성균의 역학적 연관성을 확인하고, 동일 농가에서 분리된 동일 내성균의 항생제 내성 표현형 및 내성유전자의 특성을 비교하여 PFGE 분석 방법을 통해 분리주 간의 역학적 연관성을 연구하였다. 마지막으로, 1, 2년차 기간 중 분리 된 농가 인근 지역환자 분리주를 수집하고 동정한 후, 분리균의 내성유전자를 검출하고 내성유전자 획득 현황을 파악하였으며, 농산물 및 농가환경 유래 항생제 내성균과 인근지역환자 분리주와의 역학적 연관성을 확인하였다.
초고해상도 CE-SSCP 분석을 위하여 DNA의 염기서열정보가 반영된 분리가 잘 이루어 질 수 있도록 micelle을 형성하는 polymer matrix를 개발하였다. 또한, 주요 항생제 내성균에 대한 동시적 항생제 감수성 분석 시스템을 개발하기 위하여 16S rRNA 유전자의 variable 영역에 대한 프라이머를 이용하여 Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis(vancomycin 내성), Staphylococcus aureus(methicillin 내성), Klesiella pneumoniae, Escherichia coli(Extend spectrum β-lactamase - 항생제 불활성화 효소 발현) 등을 포함한 5종 이상의 내성균에 대한 동시적 항생제 감수성 검사법을 개발하였다. 기존의 CE-SSCP 분석 시스템을 향상시킨 고해상도 CE-SSCP 분석을 적용하여 미생물 군집에서 개별 미생물을 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭이후 추가적인 반응 없이 간단하게 개별 미생물의 정량이 가능한 방법으로 개발하고, 신뢰도를 평가하기 위하여 기존의 broth dilution 방법과 비교 분석을 통하여 정확한 MIC 값의 측정이 가능한지 test 하였다. CE-SSCP를 효과적으로 병원성 미생물 다중 정량 분석에 활용하기 위하여 적절한 핵산 다중 증폭 기술이 필요기에 기존의 multiplex PCR의 비특이적 증폭의 문제를 해결할 수 있는 MLPA 기술을 도입하여 정확한 정량이 가능한 동시 검출 방법을 개발 하였다.

Abstract ▼

Recently, antimicrobial resistance of microorganisms has been a major concern of its relation to food safety and national health. This study was performed to investigate the microbial flora and antimicrobial resistance of microorganisms isolated from animal farms and slaughtering processes. Samples

Recently, antimicrobial resistance of microorganisms has been a major concern of its relation to food safety and national health. This study was performed to investigate the microbial flora and antimicrobial resistance of microorganisms isolated from animal farms and slaughtering processes. Samples were taken from animal skin, feed, drinking water, and farm environments of organic and conventional farms for cattle, cow, pig and broilers. Other samples from animal carcass, washing water, and slaughter-house environments were also taken. Indicator bacteria (Escherichia coli, Enterococcus faecalis, and Enterococcus faecium) and pathogenic bacteria (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, etc.) were identified and isolated for
antibiotic resistance analysis and genetic characterization. There were 332 indicator and pathogenic bacteria isolated from 302 samples, and antibiotic susceptibility for 20 antibiotics were analyzed and 105 bacteria showed resistance for antibiotics.
Among the bacteria isolated from animal slaughter-houses, Enterococcus spp. (n=60) showed 31.7% resistance for vancomycin, and S. aureus (n=30) showed 16.7% resistance for methicillin. Especially, 50% of S. aureus showed intermediate resistance for vancomycin. To characterize the antibiotic resistance, resistance referring genes were detected by polymerase chain reaction. The tet(A), tet(B), and tet(C) genes were found from tetracycline resistant isolates (n=95, 90.5%). Although, the patterns of detected genes in isolates from animal farms, slaughter-houses, and vegetable farms were relatively simillar, low genetic relatedness (less than 80%) was observed between antibiotic resistant E. faecalis from animal farms and vegetable farms. However, there still have need to be monitored for antibiotic resistance reduction.
In this study, we isolated foodborne pathogens and fecal indicator bacteria in 871 samples from 2010 to 2012. 583 vegetable and environmental samples were collected from organic and conventional farms. 290 fecal samples of diarrheal patients were collected by hospitals in Gyeonggi, Chungbook and Chungnam provinces in Korea. Isolated species included E. coli(n=236), Enterococcus spp. (n=459), S. aureus (n=42), and Salmonella spp. (n=9). All isolates were tested for antimicrobial susceptibility by disk diffusion method and agar dilution method. We found that the isolates from conventional farm had higher antimicrobial resistance than those from organic farm.
Moreover, human isolates was more resistant than ichorous isolates. To characterize each antimicrobial resistant E. coli trains, resistance referring genes were detected by polymerase chain reaction. tet(A), tet(B), and tet(C) genes were found in almost
tetracycline resistant isolates. sul1 and sul2 genes were highly prevalent in sulfonamides/trimethoprim-resistant strains. All streptomycin-resistant E. coli also examined for strA and strB. Although the patterns of detected genes in isolates from organic and conventional farms were relatively different, human isolate patterns were likely to be the united ones of farms' two patterns. Transfer of tet(A) and tet(B) genes was demonstrated high rates from tet(A) and tet(B) gene positive E. coli isolates to E. coli J53 by broth mating method. Low genetic relatedness was observed between the isolates from farms and patients by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). In conclusion, the reason why bacteria had been acquired antimicrobial resistance is still debated. However, the results in this study indicated the effect of using antimicrobial agents and the possibility of resistance gene transfer inter-organisms. Therefore continuous monitoring for resistance reduction should be performed.
This research is about the development of rapid anti-microbial sensitivity analysis method based on molecular biologic method, that overcomes the weak point of conventional molecular biologic method which is suffered from accuracy and sensitivity of multiplex microbe analysis. To solve the sensitivity and false-positive problem from the previous methods, MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) method was introduced. However, conventional MLPA method was hard to design new probe for broad application because of stuffer sequence, which was included for the size-based separation. In this study, the problem of conventional MLPA was solved with the two novel approaches, high-resolution CE-SSCP (capillary electrophoresis based on single
strand conformation polymorphism) and stuffer-free MLPA probe. Stuffer sequence of conventional MLPA probe was omitted in this research, to improve the convenience of the probe design. This newly introduced MLPA probe was named 'stuffer-free' MLPA probe. However, stuffer-free MLPA probe is hard to separate in the conventional CE system because of their similarity in the probe length, thus high-resolving separation CE analysis was needed. To separate the similar sized probes from stuffer-free MLPA, CE-SSCP separation was used.
However, conventional resolution of CE-SSCP was insufficient, thus the application of CE-SSCP was limited. In this study, PEO-PPO-PEO triblock copolymer matrix was developed and optimized for the high-resolution separation of CE-SSCP. By the novel method, the resolution of similarly sized DNA fragments were improved over 7-times higher than conventional CE-SSCP.
By stuffer-free MLPA and high-resolution CE-SSCP system from this research, simultaneous quantification of multiple microbes and detection of antimicrobial resistance gene was successfully done.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 8
• 목차 ... 11
• 제1장 서론 ... 12
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 14
• 제1절 축산식품유래 항생제 내성균의 분자역학적 특성분석 ... 14
• 제2절 국민 다소비 채소류와 생산환경의 항생제 내성 연구 ... 15
• 제3절 분자생물학적 방법을 이용한 신속 항생제 감수성 검사법 개발· ... 16
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 25
• 제1절 축산식품유래 항생제 내성균의 분자역학적 특성분석 ... 25
• 제2절 국민 다소비 채소류와 생산환경의 항생제 내성 연구 ... 45
• 제3절 분자생물학적 방법을 이용한 신속 항생제 감수성 검사법 개발 ... 55
• 제4장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도 ... 85
• 제1절 목표대비 달성도 ... 85
• 제2절 정량적 성과(논문게재, 특허출원, 기타)를 기술 ... 86
• 제5장 연구개발결과의 활용계획 ... 87
• ○ 미등록 및 추진 중인 논문투고계획 ... 87
• ○ 추진 중인 특허출원계획 ... 87
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 88
• I. 분자진단 기술을 이용한 항생제 내성균 검출 ... 88
• 제7장 기타 중요 변동사항 ... 93
• ○ 소과제 및 세부과제 책임자 변경 ... 93
• ○ 연도별 연구원 변동사항 ... 93
• 제8장 국가과학기술종합정보시스템에 등록한 연구장비 현황 ... 94
• 제9장 참고문헌 ... 95
• 주요 결과 요약서 ... 100