고초균 포자표면 발현시스템을 이용한 리파아제의 발현과 바이오디젤 생산에의 산업적 응용 Surface display of lipasee on the spore of B. subtilis and industrial application for the biodiesel production원문보기
▶ 1차년도: Bacillus subtilis 유래의 lipA, lipB 의 포자 표면 발현과 유기용매에서의 안정성 향상 검증 Bacillus spore에서 다양한 종류의 lipase를 표면 발현하기 위해 먼저 Bacillus subtilis 유래의 lipase 인 lipA, lipB를 발현시켜 그 가능성을 확인하고, 발현모체, linker, 발현 조건 등의 다양한 변수들을 최적화. ① 모델 lipase (lipA, lipB ) 의 포자 표면 발현 발현 모체: cotE, cotG, cotY 등의 세종류의 coat p
▶ 1차년도: Bacillus subtilis 유래의 lipA, lipB 의 포자 표면 발현과 유기용매에서의 안정성 향상 검증 Bacillus spore에서 다양한 종류의 lipase를 표면 발현하기 위해 먼저 Bacillus subtilis 유래의 lipase 인 lipA, lipB를 발현시켜 그 가능성을 확인하고, 발현모체, linker, 발현 조건 등의 다양한 변수들을 최적화. ① 모델 lipase (lipA, lipB ) 의 포자 표면 발현 발현 모체: cotE, cotG, cotY 등의 세종류의 coat protein을 이용하여 표면발현완료. 대장균/고초균 shuttle vector를 이용, 발현 모체와 lipase를 signal sequence를 제거하고 in-frame 으로 융합발현 시킴. 발현 모체와 lipase 사이에 적절한 flexible linker GGGGS등) 삽입. 표면발현 검증에 필요한 His6-tag 이 C-terminal 말단에 위치 ② 표면 발현 검증 및 lipase 활성 조사 Anti-His6 antibody 와 유세포 분석기, 형광현미경을 이용한 표면 발현 검증완료. pNPA(para-nitrophenyl acetate)와 pNPP(para-nitrophenyl palmitate)를 이용한 lipase의 활성조사 lipase중에서 esterase 에 가까운 특성을 보여주었음. ③ 다양한 유기용매에서의 안정성 조사: 다양한 logP 값을 가지는 용매 (methanol, ethanol, acetone, benzene, octanol, hexane, DMSO) 중 acetone, benzene 에 대해서 포자표면발현된 lipase의 안정성 증가. ④ Biodiesel 생산에의 시도: soy bean oil 과 methanol 이용한 trans-esterification 시도하였으나, long chain fatty acid 에 대해서는 lipB 가 반응성이 약한 것으로 보인다. ▶ 2차년도: 바이오디젤 생산을 위한 다양한 종류의 lipase 포자 표면 발현과 유기용매 안정성 검증 ① C. antarctica, M .miehei, P . flourescens 유래의 lipase 유전자 획득, 클로닝 1차년도의 결과로 cotG를 발현모체로 선정하였다. 이 중 P . flourescens 유래의 lipase가 반응성을 보임. ② 표면 발현 검증 및 lipase 활성 조사 Anti-His6 antibody 와 유세포 분석기, 형광현미경을 이용한 표면 발현 검증 ③ 다양한 유기용매에서의 안정성 조사 P. flourescens lipase의 경우, acetone, benzene 에 대해서는 soluble 한 lipase 보다 상당한 안정성의 증가 를 보였으나, THF, DMSO, alcohol 에 대해서는 비슷한 결과르 보였다. ④ Biodiesel 생산에의 시도 P. flourescens lipase를 이용하여, Methanol 과 Soybean oil을 통해 바이오디젤 합성을 확인하였다. ▶ 3차년도: 포자 표면 발현된 lipase를 이용한 바이오디젤 생산을 위한 효과적인 반응 조건, 반응기설계 ① 최종 실험을 위한 포자표면 발현된 lipase 선정 P. flourescens lipase를 이용한 시스템이 선정되었다. ② 다양한 종류의 oil 테스트 및 반응성 비교 Soybean, Olive, Canola, Grapeseed 4 가지의 plant oil을 이용하여 바이오디젤 생산을 시도하였다. ③ methanol 이외의 acyl-acceptor 사용 Ethanol 로 대체 하였을 경우, ethanol 에 비해 25% 의 전환율 저하가 있었다. ④ Trans-esterification을 위한 새로운 형태의 반응기 제작 1L 규모의 반응기에서 24 시간 반응시 78% 의 전환율을 확인하였다. 가시적인 연구성과로는 1 편의 SCI 논문을 발표하였고, 4 건의 국제학술대회 발표와 4 건의 국내 학술대회 4 건의 수상실적을 기록하였다. 이 기간 동안 1 명의 석사학위 졸업자를 배출하였으며, 1 건의 국제학술회를 개최하였다. (2011 joint of Korea/Japan/Taiwan Chemical Engineering Conference, 2011.11.10.~12, BEXCO, BUSAN)
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