초록 ▼

고초균은 많은 양의 단백질을 세포 외부의 배양액으로 분비할 수있는 능력을 가진 그람 양성 균이다. 본 연구에서는 이 고초균을 숙주로 하여 인체 프로인슐인을 세포 외부 배양액으로 분비하는 분비 발현을 시도하였다. 신호 펩타이드 유전자로서 Staphylococcus의 protein A의 신호 펩타이드와 고초균의 levansucrase의 신호 펩타이드를 이용하여 프로인슐린의 분비를 유도하였다. 전사능을 높이고자 고초균의 강력한 프로모터인 P43 프로모터를 이용하였고 높은 전사능이 오히려 분비에 방해가 될 수 있으므로약한 프

고초균은 많은 양의 단백질을 세포 외부의 배양액으로 분비할 수있는 능력을 가진 그람 양성 균이다. 본 연구에서는 이 고초균을 숙주로 하여 인체 프로인슐인을 세포 외부 배양액으로 분비하는 분비 발현을 시도하였다. 신호 펩타이드 유전자로서 Staphylococcus의 protein A의 신호 펩타이드와 고초균의 levansucrase의 신호 펩타이드를 이용하여 프로인슐린의 분비를 유도하였다. 전사능을 높이고자 고초균의 강력한 프로모터인 P43 프로모터를 이용하였고 높은 전사능이 오히려 분비에 방해가 될 수 있으므로약한 프로모터로는 levansucrase 프로모터를 사용하였다. 그러나 인체 프로인슐린의 분비발현 수율은 0.3-0.5 mg/L를 유지하여 고초균 자체 분비 단백질의 최고 분비율 (수 g/L) 에비해 매우 적게 나타났다. 대장균의 경우에서 프로인슐린의 연결 펩타이드 부위의 변형으로 분비율이 증가될 수 있었으므로 고초균의 경우에서도 연결 펩타이드를 변형하여 분비 발현을 시도하였다. 그러나 약 1,000개의 클론을 조사하였으나 대장균에서와는 달리 분비 발현이 뚜렷이 증가하는 클론을 구하지 못 하였다. 그러므로 대장균과는 다른 기작에 의해프로 인슐린이 분비 되는 것으로 생각되고 대장균과는 다른 기작에 의해 분비 발현율이 적은 것으로 생각된다. 고초균에서 자체적으로 생성되는 단백 분해 효소에 의한 프로인슐린의 분해가 저 분비 발현에 주된 요인이 될 수 있으므로 각각 단백 분해 효소가 제거된 고초균 돌연변이주를 숙주로 하여 프로인슐린을 발현시켜 분비된 프로인슐린을 조사하였다.그러나 여섯 가지의 단백 분해 효소가 제거된 숙주에서도 프로인슐린의 분비 발현율은 획기적으로 증가하지 않았다. 발현된 프로인슐린의 세포내 분해가 저분비 발현에 주된 요인인지 조사하기 위해 세포내에 프로인슐린을 western blotting과 C-peptide 방사성면역법으로정성 정량한 결과 대부분 발현된 프로인슐린이 세포 내에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이는 대장균에서와 달리 세포내 분해가 저 분비 발현에 주된 요인이 아니며 인체 프로인슐린자체의 낮은 효율로 세포막을 투과하는 것이 저 분비 발현에 주된 요인으로 생각된다. 고초균 세포 내에서 프로인슐린이 과랑 축적되어 있으므로 프로인슐린이 번역되어 나오면서분비에 적절한 구조를 이루지 못함이 저 분비 발현의 주된 이유인지 알기 위해 분자 보조체를 프로인슐린과 동시에 발현시켰다. 그러나 이 경우에도 분비율에는 급격한 증가가 이루어지지 않았다. 마지막으로 고초균을 돌연변이화 시키고 프로인슐린을 과량 분비 발현하는 클론을 골라냈다. 이 클론은 5배 이상의 발현율이 증가하였으며 분비된 단백질의 분자량으로 보아 신호펩타이드가 제거된 프로인슐린으로 생각된다.

Abstract ▼

B.subtilis is a gram-positive microorganism capable ofsecreting large quantity of extracellular protein directly into the medium. Extracellularexpression of human proinsulin was carried out by using this microorganism. Twosignal sequences, Staphylococcal protein A and Bacillus levans

B.subtilis is a gram-positive microorganism capable ofsecreting large quantity of extracellular protein directly into the medium. Extracellularexpression of human proinsulin was carried out by using this microorganism. Twosignal sequences, Staphylococcal protein A and Bacillus levansucrase were tried forsecretion of human proinsulin. The strong P43 promoter and weak levansucrasepromoter were used. The yield of extracellular expression of proinsulin was muchlower (0.3-0.5 mg/l) than most of conventional Bacillus extracellular protein (g/L).Since our previous studies have shown that the modification of mature domain ofproinsulin (C-peptide) increased the yield of export of proinsulin, the modification ofC-peptide was also tried to invetigate the change of extracellular expression. However,no clone highly expressing proinsulin has been selected. Since extracellular proteasessecreted in B.subtilis was a major obstacle to extracellular production of heterologousproteins in Bacillus, the effect of extracellular protease on secretion of human proinsulinwas investigated.. Although six protease deficient mutant starin was use as expressionhost, the ratio of increase of extracellular expression of proinsulin was not dramaticallyincreased. This result indicated that Bacillus proteases was not a critical obstacle inextracellular expression of proinsulin. Western blotting as well as C-peptideradioimmunoassay showed that most of expressed proinsulin was accumulated incytoplasm, indicating that low expression of extracellular proinsulin in B.subtilis wasdue to inefficient translocation rather than intracellular and extracellular proteolyticdegradation. To know whether the incompetent folding is a major problem in lowerextracellular expression, we expressed the proinsulin and DnaK or GroESL as molecularchaperon, simultaneously. However, the yield of extracellular expression of proinsulinwas not increased. To construct a high expression clone, we used the randomlymutated Bacillus as host. We selected one clone producing high amount ofimmunoreactive proinsulin, which incresed level of the extracellular proinsulin yield fivefold.

목차 Contents

• I. 목 차...6
• 1. 본문...7
• 1) 서론...7
• 2) 연구방법...14
• 3) 결과...19
• 4) 고찰...27
• 5) 결론...30
• 6) 인용문헌...30
• 2. 논문 목록서...33
• 3. 자체평가서...34