보고서 정보
주관연구기관 |
강원대학교 Kangwon National University |
보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
|
발행년월 | 2011-07 |
과제시작연도 |
2010 |
주관부처 |
지식경제부 Ministry of Knowledge Economy |
과제관리전문기관 |
한국에너지기술평가원 Korea Energy Technology Evaluation Institute |
등록번호 |
TRKO201300024624 |
과제고유번호 |
1415114142 |
사업명 |
전력신재생인력양성['10통합] |
DB 구축일자 |
2013-09-14
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키워드 |
Bio-diesel.Microalga.Outdoor mass culture.Perfusion cultivation.Lipid extraction.
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초록
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핵심기술
최적 관류 배양 속도에 의해 성장에 필요한 신선한 배양액과 사용된 배양액이 연속으로 순환되어 고농도 옥외 대량 배양이 가능하며, 이로부터 획득 된 미세조류로부터 다양한 전처리에 의한 세포벽 파쇄로부터 지질 추출의 최적화 및 단순화
최종목표
고 지질 함유 해양 미세조류의 효율적인 옥외 대량배양 공정 개발을 통한 경제적인 바이오디젤 생산에 관한 신기술 확립 및 해당 첨단기술을 보유한 고급인력의 연차적 양산
사업내용 및 결과
◆ 1차년도
(기술개발)
- 해수미세조류의 배양 생육 조건 분석
핵심기술
최적 관류 배양 속도에 의해 성장에 필요한 신선한 배양액과 사용된 배양액이 연속으로 순환되어 고농도 옥외 대량 배양이 가능하며, 이로부터 획득 된 미세조류로부터 다양한 전처리에 의한 세포벽 파쇄로부터 지질 추출의 최적화 및 단순화
최종목표
고 지질 함유 해양 미세조류의 효율적인 옥외 대량배양 공정 개발을 통한 경제적인 바이오디젤 생산에 관한 신기술 확립 및 해당 첨단기술을 보유한 고급인력의 연차적 양산
사업내용 및 결과
◆ 1차년도
(기술개발)
- 해수미세조류의 배양 생육 조건 분석
- 광원에 따른 배양 조건 분석
- 광원 18(hr), 12(hr), 6(hr) 조사의 경우 세종 모두 비슷하게 18(hr) 조사시 가장 빠르게 최대 균체 농도에 이르렀으며, 12(hr) 조사시 속도는 느리지만 유사한 최대 균체 농도에 이르렀음을 확인.
그 중, Chlorella minutissima는 가장 높은 8.5 (g-dry wt./L)의 최대 균체 농도를 보임.
- 30℃ 조건에서 위 광원 주기를 이용하여 지질 생성량을 평가한 결과 12(hr) 조사의 경우 35(%, w/w)의 높은 지질 생성량을 나타냄.
- glucose를 이용한 암 배양의 경우 최대 15.6%의 지질 생성량을 유지.
- 따라서 후보 3종 중, 가장 효율적인 균체 생육도와 지질생성량을 나타낸 Chlorella minutissima를 바이오디젤용 미세조류로 선정.
- 온도에 따른 배양 조건 분석
- 광원 주기에 따른 가장 효율적인 지질 생성을 보인 Chlorella minutissima를 이용하여 온도 25℃, 30℃, 35℃ 조건에서 생육도 및 지질 생성량을 비교한 결과 30℃에서 가장 효율적인 균체 생육 및 지질 생성을 보임.
- 최적 배지 비율 분석
- 바이오디젤 생산을 위한 미세조류로 선정된 Chlorella minutissima를 이용하여, 암배양시 가장 효율적인 생육 및 지질 생성을 보인 glucose의 최적 농도를 알아보기 위한 실험을 통해 10 (g/ℓ)가 최적 glucose농도임을 확인.
- 지질 함량 및 특성 탐색
- 지질 추출 최적화
- 지질 추출 결과 CHCl3 : methanol (2:1 v/v)과 ethanol 용매의 경우 solvent ratio(40%)〉extraction temperature(35%)〉 extraction time(20%)〉ultrasonification(5%) 순서로 영향을 미치는 것을 확인 하였으며, 용매비 30:1로 35℃에서 90분간 추출하는 것이 최대의 지질 추출을 위한 방법으로 선정하였으며, 용매는 지방 추출의 공정 용이 성과 용매 위험성 (비점, 냄새, 독성 등) 측면에서 에탄올 용매처리가 적합한 것으로 판단됨.
- 추출 지질의 연료화 생산능 및 특성 탐색
- Gas chromatography에 의한 지방산 조성의 정량, 정성적 분석에 의해 바이오디젤용으로 적합한 C18, C19의 함량이 25%, 28%의 높은 조성을 나타냄.
- 지질 추출 후, 부산물 활용 모색
- 일반조성, 무기질 조성, 아미노산 조성 분석을 통해 풍부한 식품 및 사료로서의 조성을 통해 가능성을 확인.
- 항암활성실험 결과 Chlorella minutissima의 정상세포에 대한 세포독성이 비교적 낮아, 부산물 이용 가능성을 확인하였으며, 각종 암세포에 대한 억제 율 은 열수 추출물에 비해 핵산 추출물에 의한 억제 율 이 월등히 높아 항암억제 소재로서의 가능성을 제시.
- 면역활성실험결과 면역 세포인 T cell, B cell의 생육 및 cytokine의 분비량을 증가 시켜 면역 활성이 비교적 높은 것으로 나타남.
- 효소실험결과 혈당강하 실험인 α-glucosidase, ACE저해 활성 실험, GST실험을 통해 각각 추출물1(g/ℓ)의 농도에서 최고 45% 이상의 저해율을 보임.
(인력양성)
- 기술 개발을 통한 인력 양성
- 유관학회 참여 신지식 습득
1. 해양바이오에너지 심포지움(서울, 2008.12.4) 참가.
2. Bioenergy Korea Conference 2009 International Symposium 참가 (2009.3.18-19, 광주)
3. 2009 한국 생물 공학회 춘계 학술 발표대회 참가 (2009.4. 9-11, 포항).
4. 국제 Industrial Biotechnology - 2009 참가 (2009. 4. 5-7, 서울).
5. (황해포럼)한중 대형 녹조 발생 학술토론회 (2009. 3. 24, 중국 청도시)
- 유관학회 논문 발표
- 국내
1. 학회명 : Bioenergy Korea Conference 2009 International Symposium
일 시 : 2009년 3월 17-19일
장 소 : 김대중컨벤션센터 4층 컨벤션홀
2. 학회명 : 2009 한국 생물 공학회 춘계 학술 발표대회
일 시 : 2009년 4월 9일-11일
장 소 : 포항공과대학교 국제관
3. 학회명 : 국제 Industrial Biotechnology - 2009
일 시 : 2009년 4월 5일-7일
(4월6일 13:30-17:00 Track 1-3 Biodiesel Bioprocessing)
장 소 : 서울 삼성동 코엑스
4. 학회명 : 2008 한국생물공학회 추계학술발표대회 및 국제심포지움
일 시 : 2008년 10월 6일-7일
장 소 : 제주 ICC
- 국외
1. 학회명 : (황해포럼) 한중 대형 녹조 발생 학술 토론회
일 시 : 2009년 3월 24일
장 소 : 중국 청도시
- 현장참여 인력양성 교육
1. 전시명 : 2009 대한민국 그린에너지 엑스포
일 시 : 2009년 4월 8일-10일
장 소 : 대구 EXCO
내 용 : 바이오 디젤 관련 연구 홍보 및 기타 신기술 개발 업체와 기술교류
◆ 2차년도
(기술개발)
- 생육 조건별 옥외 배양 공정 변수 확립
: 본 2차년도 연구는 1차년도 바이오디젤 생성을 위한 후보 3종의 미세조류 중 가장 적합한 미세조류로 선정된 Chlorella minutissima와 비교적 높은 균체 생육 및 지질 생성을 나타내는 것으로 보고되는 Chlorella sp. 2종을 비교 실험.
- 옥외 배양 생산능 탐색
- 옥외 배양 조 운용을 위한 온도에 따른 배양 생산능 탐색 결과 Chlorella sp.는 25-30℃ 조건에서 1.0-1.18 (g-dry wt./L)의 최대균체농도를 보였으며, Chlorella minutissima는 30~35℃ 조건에서 0.94-1.04 (g-dry wt./L)의 최대균체농도를 보여 각 균체의 고농도 배양을 위한 최적 온도 조건임을 확인.
- 두 균주의 배양 생산능 탐색 결과 Chlorella sp.의 경우, 최적온도 25~30℃, 광도세기 40W 조건에서 고농도 미세조류 배양이 가능함을 확인, 옥외 scale-up을 위해 높은 균체 생육과 우리나라 기온에 적합한 것으로 판단되는 Chlorella sp.를 바이오디젤 scale-up을 위한 균주로 선택.
- 옥내외 최적 배양 방법 탐색(batch, fed-batch)
- Batch/fed-batch 배양 system을 바탕으로 1 L Erlenmeyer Flask로 진행.
(Autotrophic)
- Batch : cell growth(1.7 (g-dry wt./L)) total lipid(11.0(%, w/w))
Fed-batch : cell growth(2.4 (g-dry wt./L)) total lipid(14.8(%, w/w))
(Heterotrophic)
- Batch : cell growth(2.2(g-dry wt./L)) total lipid(12.2(%, w/w))
- Fed-batch : cell growth(2.7(g-dry wt./L)) total lipid(15.6(%, w/w))
(Mixotrophic)
- Batch : cell growth(2.3(g-dry wt./L)) total lipid(13.4(%, w/w))
Fed-batch : cell growth(3.4(g-dry wt./L)) total lipid(16.8(%, w/w))
- 따라서 mixotrophic에 의한 batch, fed-batch 배양이 균체 생육을 통한 지질 생성에 가장 효율적인 조건임을 확인.
- 배양 공정 scale-up
- 옥외 배양 장치 보완 설계 제작
- 문제점 파악
· batch 배양의 경우 배양기 내에 일정한 배양액을 넣고 배양하는 방식으로 일정한 온도의 유지가 어려우며, 쉽게 영양분이 고갈되고, 독성 부산물의 축적 때문에 어느 정도의 균주 농도 밖에 자라지 못하였음.
· fed-batch의 경우 세포의 성장에 맞추어 새로운 배양액을 계속 공급해 주는 방식으로 배양액 공급 시 농축된 배양액을 이용, 지속적인 영양분의 공급으로 균주의 농도를 높게 올릴 수 있지만, 배양 말기에 노폐물의 축적 및 영양소들의 심한 불균형에 의해 생육이 저하됨.
· 따뜻한 지역에서 주로 이루어지는 옥외 대량 배양 시, 우리나라는 중위도에 위치하고 있으며, 겨울철 북서풍의 영향으로 온도가 영하로 떨어져, batch, fed-batch에 의한 옥외 대량 배양의 한계점
- 따라서, 14ℓ 관류 광 배양 장치 설치 (기존 옥외 배양 시 이용된 14ℓ 배양 장치 보완)
- 배양 조 운용 및 scale-up 공정 변수 확립
- 최적 perfusion rate 정립을 위해 0.1-1.2 (L/hr)에 따른 온도 변화를 통하여, 1.0~1.2 L/hr의 최적 perfusion rate 정립.
- water bath가 설치된 관류 광 배양 장치를 통해 높은 온도의 seawater가 연속적으로 들어가고 나감으로써, 7.1 (g-dry wt./L)의 높은 균체 농도와 21.6 (%, w/w)의 높은 지질 생성을 나타냄.
- 설계된 배양 조에서 얻어진 바이오디젤 분리 수율 증진 및 연료 특성 탐색
- 지질 특성 탐색
- Nile red staining
: 세포안쪽의 노란색과 바깥쪽 붉은색이 모두 확인되어 시료는 hydrocarbon을 포함하는 지방과 triglyceride 및 극성지방을 모두 함유하고 있음을 확인.
- TLC 분석
: 추출된 지방으로부터 triacylglyceroldml 확인을 위해 TLC로 확인한 결과, mono-, di-acylglyceride는 확인되지 않았으나, triacyglycerol 성분의 존재를 확인.
- Gas chromatogram
· Procedure A의 경우 불포화지방산은 포화지방산에 비해 약 3.8배 높음.
· Procedure B의 경우 불포화지방산은 포화지방산에 비해 약 4.6배 높음.
· Chlorella sp.로부터 생성된 바이오디젤은 불포화 지방산의 함량이 높아 저온 유동성이 좋으나 산화 안정성이 다소 낮을 것으로 사료됨.
- 지질 추출 공정, 회수율 증진 기술 개발
- 용매의 선정 및 추출 횟수의 결정
(용매의 선정)
· Chlorella sp.의 건조시료와 습시료를 이용하여 5가지 용매 (acetone, chloroform/methanol (2:1, v/v), ethanol, hexane/ether (1:1, v/v), hexane)를 사용하여 각 용매별 추출 수율 측정.
· 최저 및 최대 추출 수율은 약 10배의 차이를 보임.
· 추출 용매가 건조 시료에 미치는 영향을 살펴 보기 위해 nile red staining하고 공초점 현미경으로 관찰한 결과 추출 전에는 노란색의 중성지방이 많이 관찰되는 반면, 추출 후에는 노란색 보다는 붉은색의 극성지방이 많이 관찰되어 중성 지방의 추출이 이루어 졌음을 확인.
- 추출횟수의 선정
· 1회 추출(16%), 2회 추출(2.5%), 3회 추출(0.75%)로 추출 횟수의 증가에 따른 수율의 증가 효과는 무시될 수 있는 수준, 따라서 추출 횟수는 1회가 적합.
· 전방계 주사형 전자현미경(SEM)을 통해 관찰한 결과, 반복할수록 시료가 응집된 덩어리의 갈라짐과 깨짐 현상이 증가.
· Nile red staining하고 공초점 현미경으로 관찰한 결과, 1회 추출 시 대부분의 노란색의 중성 지방은 줄어들고 붉은색이 증가하였으며, 반복 추출 시에는 붉은색이 더욱 증가함.
· 그러나 2, 3회 추출은 큰 차이를 보이지 않아 1회로 지방 추출이 충분한 것으로 사료됨.
· 시료(동결건조시료), 추출 용매(Chloroform/methanol (2:1, v/v)용매를 사용하여 1회추출 하는것이 가장 적합, 이하의 실험에 적용.
- 전처리 방법의 선정
· 시료를 microwave, ultrasonification, homogenization 방법으로 전처리.
· microwave(2450MHz, 5min) / ultrasonification(47kHz, 10min) / homogenization(1200psi) 조건으로 처리
· homogenization 전처리 시, 중성 지방의 대부분이 추출되어 바이오디젤 생성에 효과 적임.
· SEM, Nile red staining, TLC를 통하여 화인 (SEM)
- Homogenization 처리시에는 20㎛ 이하의 구형의 모양이 응집되어있는 형태가 뚜렷하게 관찰.
- 시료의 응집된 덩어리를 각 biomass로 분리하고 또 세포벽의 손상을 주어 세포내의 지방 추출을 증가시킬 수 있음을 확인.
(Nile red staining)
- 추출 전과 비교하여 노란색의 중성지방 보다는 붉은 색의 극성지방이 많이 관찰되어 중성지방의 추출이 이루어 졌음을 확인.
- homogenization 전처리 시, 중성 지방의 대부분이 추출 되어 바이오디젤 생성을 위한 지질 추출 시 상당히 효율 적인 것으로 판단.
(TLC)
- 추출 성분 중, 바이오디젤의 주 원료 성분이 되는 triacylglycerol을 지표물질로 비교하여 보았을 때, homogenization 처리의 spot이 다른 전처리 시료의 spot에 비해 다소 크고, 보다 짙은 농도를 나타냄.
- 따라서, homogenization 처리시에 수율이 더 높고 또 triacyglycerol의 함량이 높은 것으로 생각되며, 전처리 방법으로 가장 적합하다고 판단.
- 추출 시간의 결정
· 상온에서 각 시간별(5 min ~ 5 hr)로 추출 수율을 조사, 이때, 시료1g을 정확히 칭량한 후 상기 방법에서 최적 용매로 선정된 chloroform/methanol (2:1, v/v) 용매 30mL을 넣어 교반기(400rpm)로 교반하였으며, 각각의 전 처리를 이용하여 추출.
· 추출 시간이 증가함에 따라 각 전처리로 추출 수율이 대조구보다 전반적으로 증가하는 경향을 보임.
· ultrasonification, microwave 처리는 미미한 추출 수율의 증가를 보였으나, homogenozation은 짧은 시간인 5분의 추출에서 7%, 5시간의 추출에서 11.4%의 추출 수율을 보임.
(인력양성)
- 기술 개발을 통한 인력 양성
- 연 2회 이상 관련 기업 보율 기술 교육 및 전문가 초청 세미나
· 기술교육
1. 2009년 8월 20일 (주)두산에코비즈넷에서 8시간 동안 과제 보조연구원인 한재건, 오성호, 김영, 김나영 이상 4명의 학생은 해양미세조류의 배양 scale-up 최적 방법에 관한 기술 교육을 받음
2. 2009년 9월 10일 (주)네오텍에서 4시간 동안 과제 보조 연구원인 한재건, 오성호, 김영, 김나영 이상 4명의 학생은 지질 추출 방법에 관한 기술 교육을 받음
· 전문가 초청 세미나)
1. 2009년 10월 13일 강원대학교 생물소재공학과 전공 세미나실에서 강원대학교 식품공학과 윤원병 교수님의 반응 표면 분석법(RSM Analysis)에 관한 세미나를 개최
2. 2010년 1월 9일 강원대학교 생물소재공학과 전공 세미나실에서 바이오디젤 관련 연구를 진행중인 한국해양연구원 강도형 박사님을 초청하여 “Lipid extraction method for biodiesel production from marine microalga”에 관한 세미나 개최
3. 2010년 2월 8일 강원대학교 생물소재공학과 전공세미나실에서 (주)두산에코비즈넷의 조정섭 상무님을 초빙하여 “Scale-up method of marine micralga Chlorella sp.” 에 관한 세미나 개최
- 관련 기업 인턴 교육
1. 2009년 4월 1일부터 30일 까지 본 과제 보조연구원인 김가빈, 오성호, 최운용, 권민철 이상 4명의 대학원생은 (주)두산에코비즈넷에서 바이오디젤관련 실무교육을 받음
- 유관 학회 논문 발표 및 홍보
- 국내외 유관학회 참여 및 논문발표 역량향상
· 국내
1. Improvement of Biodiesel Production by Mixotrophic Growth of Chlorella minutissima(한국미생물생명공학회, 날짜(2009.6.25-26, 장소(대전컨벤션센터))
2. Optimigation of Recycling Culture System for Biodiesel Production from Chlorella minutissima(한국미생물생명공학회, 날짜(2009.10.22-23, 장소(서울교육문화회관))
3. Process of Maintaining Constant Temperature for Mass Cell Cultivation of Chlorella minutissima for Biodiesel Production(한국생물공학회, 날짜 (2009.11.2-3), 장소(대전컨벤션센터))
4. Scenedesmus sp.로 부터의 지방 추출. 정제 및 특성(한국산업식품공학회, 날짜(2009.11.27), 장소(삼성동 COEX 컨퍼런스룸)
5. Mixotrophic Cultivation of Chlorella sp. for Biodiesel Production (바이오에너지 코리아 컨퍼런스 2010 국제심포지엄, 날짜 (2010.3.18-19), 장소(광주김대중컨벤션센터)
6. Effects of Light Illumination Cycle on Mixotrophic Growth of Chlorella sp. for Biodiesel Production(한국생물공학회, 날짜(2010.4.15-16), 장소(경원대학교))
· 국외
1. CELL GROWTH AND TOTAL LIPID OF CHLORELLA MINUTISSIMA BY LONG-TERM CULTIVATION(TSB 2009, 날짜(2009.9.24-25), 장소 (태국 방콕))
2. Growth of Chlorella minutissima according to Carbon sources under Mixotrophic Condition for the Production Biodiesel (WORLD ACADEMY OF SCIENCE, ENGINEERING
AND TECHNOLOGY, 날짜(2010.4.27-30), 장소(로마))
3. Outdoor Mass Cultivation of Chlorella minutissima by Using Thermal Plume(ICBB2010, 날짜 (2010.5.26-28), 장소(도쿄))
- 바이오디젤 홍보 : 강원도민일보(인물면, 날짜(2009.9.18))
- 현장 참여 인력 양성 교육
1. ENTECH 2009 국제 환경․에너지 산업전 참가 (2009.9.16~19, 부산 BEXCO)
2. 글로벌 에너지 인재양성 혁신 Workshop 참가 (2010.2.25-26, 제주도)
◆ 3차년도
(기술개발)
- 옥외 대량 생산 및 연속배양 가능 system 구축 및 옥외 대량 배양공정 최적화
- 200L 옥외 대량 배양 조 설계 및 제작
- 1차년도(Erlenmeyer flask), 2차년도(14L Scale-up) 실험 설계 및 결과를 바탕으로 정립된 대량배양 공정 확립을 바탕으로, 옥외 대량 배양의 실증화를 위한 200L 옥외 관류 배양 장치가 각각 20L photo-bioreactor의 plastic vessel 10개로 도면 설계 및 제작
- 2차년도 14L 관류배양장치의 도면을 바탕으로 3차년도 옥외 200L scale-up을 위해 제작된 200L 관류배양장치의 도면과 같이 관류식 배양(perfusion culture) 공정을 이용한 균주의 배양 방법은 매우 효과적으로, 기존의 회분식 배양과 유가식 배양 공정의 경우, 배양 방식이 쉽기는 하나 회분식 배양은 고농도의 세포를 얻기 어려우며, 유가식 배양은 고농도의 세포를 얻을 수 있지만 배양액 공급 시 농축된 배양액을 사용하여 배양 말기에 노폐물의 축적 및 영양소들의 심한 불균형을 초래 함.
- 이에 비해 관류식 배양은 신선한 배양액이 연속적으로 공급되며, 사용 된 배양액을 연속적으로 제거해 줌으로써 고농도 배양이 가능 함
- 본 200L scale-up 배양에서는 옥외 배양 조건에서 30℃의 일정한 온도를 유지하기 위해 그 동안 생태계 파괴 및 다양한 문제로 여겨지던 약 40℃ 정도의 원전 온배수를 이용하여 바이오디젤 생산 원료인 해수미세조류의 biomass를 높이는데 활용함으로써, 상당히 가치 있는 연구로 사료 됨.
- 공정 변수 확립 및 최적화
: · 원전 온배수 활용을 통한 200L 옥외 배양 공정 변수 확립
- 해수의 겨울 철 평균 온도는 3℃ 정도로 매우 낮아 해양미세조류의 성장이 매우 느릴 것으로 보이며, 원자력 발전소에서 배출되는 원전 온배수의 경우 34~36℃의 높은 온도를 나타내어 추운 겨울 미세조류의 성장에 상당히 효율 적일 것으로 판단됨.
- 일반 해수와 원전 온배수의 mineral 조성 비교 시, 큰 차이를 보이지 않아 상대적으로 높은 온도를 나타내는 원전 온배수의 미세조류 옥외 대량 배양에 활용 가능한 것으로 보임.
· Light intensity를 통한 배양 영양 조건 확립
- 추운 겨울 철, 자연광 조사 시, 정오의 평균 light intensity는 약 48×109 W/cm2으로, 최적의 성장 조건 이였으며, 하루 동안의 light intensity는 0~61.4×109 W/cm2 을 보임.
- 이것은 미세조류 성장 조건이 autotrophic 또는 mixotrophic부터 heterotrophic으로 반복 순환 되어 성장이 크게 변화됨을 의미
- 그러므로 자연 조건에서의 옥외 배양 시, mixotrophic 성장이 가장 적합하고 밤에도 일정한 균체 성장을 유지 가능함을 보여줌.
- 해수와 원배수의 batch조건에 의한 Mixotrophic 배양 결과 해수에서 배양된 미세조류는 성장이 매우 어려웠으며, 배양 12일 째 cell down이 일어나는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 약 평균 배양 온도가 3℃로 낮기 때문으로 사료 됨.
- 반면, 0.03 g/L로 접종한 원전 온배수 조건에서의 미세조류는 0.09 g/L의 최대 cell concentration을 나타내었으며, 15일 이 후, cell들이 점진적으로 감소하였는데, 이는 배양 온도가 11℃로 낮아 졌기 때문으로 사료 됨.
- 이러한 실험을 통하여, 온도 변화에 따른 Chlorella sp.의 성장을 확인 하였으며, 배양을 위한 최소 옥외 배양 온도 조건은 11℃임을 확인
· 관류배양속도에 따른 200L 옥외 배양 공정 변수 확립
- perfusion rate가 관류배양공정 동안 일정한 온도를 유지하는 가장 큰 요소임을 확인
- 2.8 L/hr perfusion rate에서 reactor의 온도가 평균 33℃를 유지함을 확인, 그러나 더 빠른 3.0 L/hr 에서는 2.8 L/hr보다 더 높은 균체 생육을 나타낼 것으로 보였으나, 오히려 감소하는 결과를 보임
- 이는 아마도 높은 perfusion rate에 의한 shear stress와 빠른 배양 배지의 공급 만큼 필터 막힘으로 인하여, 적절하게 성장 하지 못하는 것으로 사료 됨.
- 1.5 L/hr 이하의 느린 perfusion rate에서 cell growth가 크게 증가 하지 못하는데, 이는 느린 perfusion rate에 의해 효율적인 cell growth를 유지하기 위한 적절한 온도 유지가 어렵기 때문 임.
- 반면 1.5 L/hr 이상의 빠른 속도 에서는 영양 배지와 carbon source의 적절한 공급과 함께 적절한 온도가 유지 되므로 높은 성장 율을 보임.
- 지질 생산에 있어서 perfusion rate는 cell growth에 비해 덜 영향을 미치는 것으로 나타났으나, 월등히 높은 18.3 (%, w/w)의 지질 생산이 3.0 L/hr의 높은 perfusion rate에서 관찰됨
- 해양미세조류의 200L 옥외 대량 배양
- 2.8 L/hr의 최적 perfusion rate에서 autotrophic(조건 : CO2 5 %(v/v) 공급)과 mixotrophic(조건 : glucose 10 g/L, CO2 5 %(v/v) 공급) 성장 조건에서의 cell concentration과 lipid production을 비교
- 두 배양 조건 동안, reactor 내부 온도가 30~35℃로 유지되었기 때문에, celle들은 80일 까지 배양 되었으며, mixotrophic 성장 동안 지속적인 성장을 나타냄.
- Autotrophic 성장의 경우 최대 cell concentration(3.8 g-dry wt./L), total lipid production(13.1 %, w/w)의 최대치를 나타냄.
- mixotrophic 성장의 경우 지속적 균체 성장을 보임으로써, 최대 cell concentration(8.3 g-dry wt./L), total lipid production(23.2 %, w/w)의 최대치를 이룸.
- 그러나, 자연 상태에서의 옥외 대량 배양은 배양 배지가 쉽게 오염되어 미세조류의 지속적인 성장이 어려우며, carbon source로써 glucose는 고비용으로 경제성이 낮음.
- 따라서, 비용이 저렴하고 살균도가 높아 옥외 대량 배양시, 배양 배지의 오염도가 낮아 옥외 장기 배양이 유리할 것으로 판단되는 methanol의 활용 가능성 평가
· Photo-bioreactor에서 carbon source로써 methanol의 활용 가능성 및 최적 methanol 농도
- methanol의 최적 농도는 최대 cell concentration 4.2 (g-dry wt./L)와 total lipid production 17.5 (%, w/w)를 나타낸 methanol 1% (v/v)이 옥외 대량 배양을 위한 최적 methanol 농도로 결정
- methanol 0% (v/v)인 autotrophic 성장에서는 각각 1.8 (g-dry wt./L)와 12.5 (%, w/w)의 균체 생육 및 지질 생성량을 나타냄으로써, methanol이 균체 생육 및 지질 생성과 깊은 관련이 있음을 입증함
- 0.5% (v/v) 농도에서는 배양 초기에 가장 빠른 균체 성장률을 보임과 동시에 배양 말미에는 급격하게 감소하는 모습을 보인 반면, 지질 생성량은 지속적인 증가를 보여주는데, 이는 배양 초기에는 methanol을 carbon source로써 주요하게 사용하였으며, methanol이 다 소진 된 이후에 carbon source로써 이산화 탄소를 주요하게 사용 되었기 때문임
- 고농도 methanol 3% (v/v)의 경우 총 지질 생성량이 0.9(%,w/w)으로 매우 낮은데, 이는 고농도 methanol의 경우 독성이 있어, 조류가 사멸하며, 지방산이 세포외로 급속히 유리되기 때문으로 사료 됨
- 따라서, 본 연구 결과는 옥외 배양 시, 배지 오염과 경제성의 단점이 따랐으나, methanol 1.0% (v/v)을 carbon source로써 활용 한다면, 탁월한 살균 효과력으로 저비용으로 장기 대량 배양이 가능할 것으로 사료 됨
· methanol을 이용한 mixotrophic 배양 시, CO2와의 소비 형태 비교 분석
- 배양 45일 동안, methanol 1% (v/v)의 소비량과 CO2의 잔존량의 변화를 살펴본 결과, methanol은 배양 초기에 미세조류의 흡수가 거의 이루어 지지 못하였으나, 이후, 급격히 소비가 증가하는 모습을 확인 할 수 있는데, 이는 배양 초반에는 methanol이 투입되는 배지의 적응 기간으로 판단되며, 배양 30일 까지는 대부분의 methanol이 소비 됨
- Dissolved CO2의 량을 살펴보면, 배양 후반에는 급격히 감소하는 현상을 볼 수 있는데, 이는 배양 중반 까지는 유기 탄소원으로 methanol이 CO2와 함께 대부분 소비되며, 배양 후반에는 CO2가 주요 carbon source로써 이용되기 때문으로 사료 됨
- 본 실험을 통해 methanol의 기질 소비 속도(qs)는 배양 초반에 증가하고 CO2의 기질 소비 속도(qs)는 배양 초반 보다 배양 후반에 증가하는 것을 확인 할 수 있으며, 대부분의 methanol이 배양 초반에 세포내로 흡수되어 호흡작용과 여러 대사작용에 관여하여 지질 생성에 영향을 미치는 것으로 사료 됨
· carbon source로써 methanol과 CO2에 따른 지방산 조성 변화를 비교
- methanol은 CO2에 비해 glycolipid의 합성에 많이 이용되어 총 지질 생성량이 증가하며, 특히, 바이오디젤 생산에 중요한 짧은 사슬의 불포화 지방산 함량이 높음을 확인 함
- methanol과 CO2의 포화 및 불포화 지방산 함량을 살펴보면, C16:0(Palmitic acid), C16:1(palmitoleic acid), C18:0(stearic acid), C18:1(oleic acid), C18:2(linoleic acid), C18:3(linolenic acid)은 각각 13:9, 6:5, 8:7, 15:11, 9:10, 13:10을 나타냄
- 따라서, methanol의 이용은 유용 지방산 축적에 매우 탁월하며, 살균효과가 매우 높아 옥외 배양 시 매우 효과적일 것으로 사료 됨
- 해수미세조류로부터 연료화 수율 향상을 위한 효율적 바이오디젤 생산방법 및 품질평가
- 해수미세조류 유래 바이오디젤 생산의 최적화
· Simultaneous lipid extraction/transesterification process (in situ process) 검토 (Two step → one step in the same vial)
- 전이에스테르화(transesterification)방법은 추출된 oil에 이용한 전환반응을 통해 FAME (fatty acid methyl ester, biodiesel) 생성하는 반응으로 추출과 반응이 분리되어 있기 때문에 복잡하며 공정시 추출비용 등의 추가로 생산비용 절감에 어려움이 있어서, 궁극적으로 바이오디젤 가격에 매우 큰 영향을 미치게됨
- In situ transesterificaiton (혹은 direct transesterification 방법은 oil이 함유된 원료로부터 oil의 추출없이 추출과 전이에스터반응을 동시에 진행시켜 직접 바이오디젤로 전환시키는 방법으로 oil 추출 후의 전이에스테르화(transesterification) 방법과 비교하였을 때, 용매 및 반응시간의 소비를 감소시키고, 바이오디젤 수율을 향상시킴
- 따라서, 산 또는 염기촉매하의 in situ transesterification에 의한 바이오디젤 생산을 시도하였고, Taguchi 법 및 반응표면분석법에 의해 생산 최적화를 실시하였고, 아울러, 생산된 바이오디젤의 특성분석 및 품질평가를 통해 연료적합성을 평가하였음
· 염기촉매를 이용한 in situ transesterification
- Taguchi 법에 의해 염기촉매를 이용한 in situ transesterification에 의해 생성된 바이오디젤의 수율을 토대로 얻은 인자효과의 크기순서는 반응온도(47.5%)> 용매량(26.7%)> 반응시간(17.5%)> 촉매량(8.3%)이었고, 각 인자의 최적수준은 반응온도 60℃, 반응시간 2시간, 0.5% NaOH 및 50 mL의 Met-OH 첨가조건이었으며, 이 때의 수율은 55.7%이었고, p<0.05에서 통계적인 유의성을 보임
- 염기촉매하에서 얻어진 바이오디젤에 색소로 추정되는 물질이 다량 함유되었음을 확인하였고, silicic acid column chromatography를 통해 색소물질을 분획, 이를 UV-VIS spectropotometer로 scanning (400-700 nm)한 결과, chlorophyll임을 확인 할 수 있었음
· 산촉매를 이용한 in situ transesterification
- Taguchi 법에 의해 산촉매를 이용한 in situ transesterification을 통해 바이오디젤의 생산수율에 영향을 미치는 인자효과를 분석한 결과, 크기순서는 용매비 (17.13%)> 촉매량(14.27%)> 반응시간(9.83%)> 반응온도 (8.63%) 순이었고, 각 인자의 최적수준은 70℃, 10 시간, 5% H2SO4 (% of solvent, v/v) 및 15:1 mL (v/w of biomass)의 Met-OH 첨가 조건이었으며, 이때의 전환수율은 48.41% (base on oil weight)로 p<0.05 에서 통계적인 유의성을 보였음
- 따라서 수율 향상을 위해 세포벽 파쇄를 위한 high pressure homogenization (1000~1200 psi)의 전처리를 실시한 결과, A 방법의 경우는 high pressure homogenization 하였을 때 58.01%로 균질화하지 않은 경우(48.41%)보다 약 10%가 증가하였고, B 방법에서도 high pressure homogenization처리로 51.67%에서 61.21%로 약 10%의 수율증가가 나타나 high pressure homogenization 전처리가 바이오디젤 생산에 효율적이라 판단되었고, 이후 반응표면분석실험은 전처리 시료를 사용하여 실시하였음
- 해수미세조류 유래 바이오디젤의 특성 평가
· GC (gas chromatography)
- 생성된 바이오디젤의 조성분석을 위하여 GC를 실시한 결과 생성된 methyl ester는 C16~C18의 포화 및 불포화 지방산을 함유하였고, 바이오디젤의 지방산 함량순서는 C18:2> C16:2> C16:0인 것으로 나타났음
· FT-IR (Fourier transformed infra red)
- 생성된 바이오디젤의 특성구조 분석을 위하여 FT-IR을 실시한 결과 원료물질인 TAG에서 in situ transesterification을 통해 FAME가 생성된 것이 관찰되었고, 본 실험의 바이오디젤과 commercial 바이오디젤을 비교하였을 때 IR 특성값들이 거의 일치하는 결과를 얻을 수 있었음
· 1H NMR
- 생성된 바이오디젤의 특성분석을 위하여 1H NMR결과 TAG (triacylglyceride) 에서는 나타나지 않던 methoxy proton이 나타나 FAME화된 것을 확인할 수 있었고, FAME 전환율은 95.5%로 commercial 바이오디젤의 전환율(95.3%) 이상임을 알 수 있었음
· TGA (thermogravimetric analysis) and Elemental analysis
- TGA 결과로부터 산출한 proximate analysis 결과, biomass는 수분 4.93%, 휘발성 물질 75.71%, fixed carbon 3.93% 및 회분 20.36%의 조성을 나타내었는데, commercial 바이오디젤과 본 연구에서 얻은 algae 바이오디젤은 수분, 고정탄소 및 회분 값이 각각 0%, 0% 및 0.01~0.34%로 감소하였고, 휘발성물질은 99.66~99.99%로 증가하였으며, Commercial 바이오디젤과 algae 바이오디젤은 거의 유사한 조성을 보였으며, 이들 값은 ASTM 및 유럽 디젤규격기준에 적합하였음
- 원소분석(elemental analysis)결과는 biomass에서 C 47.75%, H 6.89%, O 24.65%, N 8.29%, S 0.30%의 결과를 얻은 반면 commercial 바이오디젤 및 Algae 바이오디젤의 C, H, O, N, S의 함량은 74.77~76.76%, 11.21~11.49%, 10.20~13.01%, 0.64~0.65%로 algae 바이오디젤의 C 및 O 함량이 높았고 H 및 N은 유사한 함량을 보였음
- S (sulfa)의 경우 commercial 바이오디젤에서는 0.05%의 함량을 나타내었지만 algae 바이오디젤에서는 검출되지 않아, 검출한계 이하의 함량을 지닌 것으로 판단됨
- 원소분석결과를 이용하여 calorific value를 계산한 결과, HCV (higher calorific value)는 biomass 21.46 MJ/kg, commercial 바이오디젤 36.17 MJ/kg, algae 바이오디젤 36.37 MJ/kg 이었음
- LHV (lower calorific value)는 biomass 11.38 MJ/kg, commercial 바이오디젤 22.83 MJ/kg, algae 바이오디젤 23.16 MJ/kg로 HCV, LHV 모두 algae 바이오디젤의 calorific value가 가장 높았음
- 따라서 연료로서 algae 바이오디젤이 commercial 바이오디젤보다 더 효율적임을 예상할 수 있었음
- 해수미세조류 유래 바이오디젤의 경제성 평가
- 최소 50 m × 50 m = 2,500m2(약 0.5 에이커)의 규모
- 30 ton의 배양 조(폭 3m, 길이 15m, 수심 0.6m) 에서는 15 kg/day
biomass 생산 가능
- 2,500 m2(0.5 에이커) 안에 5~10개의 30 ton 배양 장
치 설치를 통해
- 하루에 Biomass (75-150 kg/day) 생산 가능.
- 연중에 Biomass (27-54 ton/year) 생산 가능.
- 바이오연료 추출 기준 범위인 5-10% 적용 시 5-10 개의 중규모 배양 장치에서 연간 2.7-5.4 kL 바이오 디젤 생산 가능
- 공정부산물은 30% 이상의 단백질을 포함한 연간 20 ton 이상의 양질의 사료원 생산 가능
(인력양성)
- 기술 개발을 통한 인력 양성
- 논문발표 및 현장참여 인력양성 교육
· 국내외 유관학회 참여 및 논문발표 역량향상
· 현장참여 인력양성
1. ENTECH 2010 국제 환경 ․에너지 산업전 참가 (2010.09.01 - 04, 부산 BEXCO)
- 해외 학회 참가
1. Availability of marine microalgae Chlorella minutissima as by product from lipid from extraction process for biodiesel production (JAACT 2010, 날짜 : 2010.09.01-0.4, 장소 : 일본 삿포르)
- 관련 기관의 전문가 초청 세미나 개최
1. 2010년 10월 18일(월) 강원대학교 생물소재공학과 전공 세미나실에서 강원대학교 식품공학과 윤원병 교수님의 지질 추출의 최적화 조건 2차 정립을 위한 반응 표면 분석법(RSM Analysis)에 관한 세미나를 개최
2. 2011년 2월 8일(화) 강원대학교 생물소재공학과 전공 세미나실에서 한국해양연구원 강도형 박사님을 초청하여 해양미세조류의 고농도 배양을 위한 옥외 scale-up의 최적화에 관한 세미나 개최
- 관련 기업의 기업 연수
1. 2010년 12월 28일부터 31일 까지 본 과제 보조연구원인 오성호, 김가빈, 최운용 이상 3명의 대학원생은 (주) 네오텍에서 바이오디젤관련 실무교육에 관한 연수를 받음
- 유관 기업의 취업을 위한 회사 탐방
1. 2010년 8월 30일(월) : (주)네오텍
2. 2010년 9월 10일(금) : 애경유화 기술원
3. 2011년 2월 8일(화) : (주)두산에코비즈넷
배경
○ 바이오디젤 생산 및 보급에 있어서 가장 중요한 요소는 원료 (Feedstock)이다. 바이오디젤 생산비용의 85%까지 차지하는 원료를 어떻게 조달하느냐가 바이오디젤사업의 성공요소이다.
○ 그러나 우리나라는 국산 곡물자원 확보의 문제점으로 인해 국산 식물성오일을 이용한 바이오디젤 생산에 한계점을 지니고 있다. 이와 같은 문제를 해결해 줄 수 있는 것이 해수미세조류의 바이오디젤 원료로의 이용이다.
○ 해수미세조류의 경우, 단위면적당 원료 생산량이 많고, 육상작물에 비해 성장속도가 빨라 국내에서는 1년에 3, 4번, 동남아시아에서는 5, 6번까지 양식이 가능하다.
○ 이에 해수미세조류로 부터의 바이오디젤 생산은 경제성 면에서도 경쟁력을 가진다. 단위면적당 원료 생산량이 높고 생산 주기가 짧아 풍부한 원료의 수급이 가능하기 때문에 현재 바이오 디젤 생산에 있어 문제점으로 제시되는 원료 수급의 문제점이 해결 될 것으로 보인다.
○ 대부분의 해양미세조류는 1980년대까지 우리나라 해안의 적조현상의 주범이었다. 그러나 연구결과 세포의 20%가 지방과 oil로 구성되어 있음이 확인되었다. 따라서 바이오디젤을 위한 원료로서의 가능성이 매우 뛰어나다.
○ 따라서 해양미세조류부터의 바이오매스의 생산은 경제성 면에서도 경쟁력을 가지며, 단위면적당 원료 생산량이 높고 생산주기가 짧기 때문에 풍부한 원료의 수급이 가능할 수 있다.
○ 더욱이 해수미세조류 바이오디젤 생산기술은 세계적으로도 아직 상용화되지 않았기 때문에 지금이 해조류로부터의 바이오에너지 생산 기술의 선점 기회이다.
○ 지식경제부는 지속적으로 에너지 산업의 성장동력화에 필요한 에너지·자원분야의 우수 연구인력을 양성하고 산업체 현장 인력을 재교육하는 ‘에너지·자원 인력양성사업’을 추진하고 있다.
○ 그동안 에너지원 별로 에너지관리공단, 신재생센터, 전력기반 조성센터 등 3개 기관에서 추진하던 인력양성 사업을 ‘한국에너지자원기술기획평가원’으로 전담기관을 일원화해 올해 사업관리를 효율화 할 계획이다.
○ 본 연구진은 각각 바이오에너지 생산 기술 및 기능성 소재화 공정 기술 개발에 필요한 풍부한 선행연구결과 및 첨단 기술을 보유하고 있는 선두 연구진으로 적극적이고 효율적인 사업 운영을 통해 국가적 전략기술의 개발 및 인력양성 기반형성이 가능할 것으로 기대된다.
○ 또한 이러한 개발초기 시점에서 해양미세조류를 관리하고 활용방안을 연구하는 인력의 양성은 시급하고 절실한 시점이라고 판단된다. 따라서 본 사업에서는 해양미세조류로부터 경제적인 바이오디젤 생산에 관하여 효율적이고 국내 및 국제적으로 경쟁력을 가질 수 있는 기술을 개발을 통한 고급인력의 양성을 도모하고자 한다.
○ 이에 본 연구 인력양성 사업방안을 통하여 국가의 바이오에너지 생산체제의 수립 및 효율적 이행을 하는데 장점을 가질 것으로 예상되며 선진 수준의 해양미세조류배양 기술 및 바이오디젤 생산기술개발에 이바지 할 것으로 예상 된다.
핵심기술의 의의
○ 기존의 회분식(batch) 배양과 유가식(fed-batch) 배양 공정은 배양 방식이 쉽기는 하나 회분식 배양의 경우 고농도의 세포를 얻기 어려우며, 유가식 배양은 고농도의 세포를 얻을 수 있지만 배양액 공급 시 농축된 배양액을 사용하여 배양 말기에 노폐물의 축적 및 영양소들의 심한 불균형을 초래함.
○ 이에 비해 관류식 배양은 신선한 배양액과 spent medium이 최적화된 perfusion rate에 의해 연속적으로 공급되고 배출됨으로써, 고농도 배양이 가능함.
○ 그러나, 바이오디젤 생산의 산업적 규모로 성장하기 위해서는 옥외 대량 배양이 필수 적이나, 중위도에 위치한 우리나라는 추운 겨울 북서풍의 영향으로 온도가 낮은 편이어서 따뜻한 열대 지역에서 주로 이루어지는 해양 미세조류의 옥외 배양을 수행하는 것이 곤란하여 옥외 배양 시 일정한 온도를 유지 하는 것이 필수 적임.
○ 발전소에서 배출된 원전 온배수는 지금까지 그대로 해수의 수온이 올라가 생물에 나쁜 영향을 미쳐 온배수가 문제가 되는데, 해수조류는 단위면적당 생산량이 많고 육상식물에 비해 성장속도가 빨라 대량 양식을 통한 원료의 수급 및 산업화의 가능성이 매우 높음.
○ 따라서, 생태계를 파괴하는 등 나쁜 영향을 줌에도 불구하고 달리 관리하기가 어려웠던 원전 온배수는 해양 미세조류의 옥외 배양에 활용됨으로써, 에너지 활용과 환경오염 해결에 기여하며, 옥외 배양하는 것은 기온이 높은 지역에서만 가능하였는데, 원전 온배수를 공급받을 수 있는 지역이라면 기온이 낮은 지역이라 하더라도 옥외 광배양이 가능 함.
○ 특히, 이 기술은 폐기물 배출이 전혀 없는 친환경 적인 바이오에너지 기술 선점의 기회이며, 한국의 지형적, 기후적 특성에도 가장 적합한 기술로 평가 됨.
○ 추출 부산물 활용 방안을 모색하기 위한 식품 화학 성분 분석결과 풍부한 탄수화물, 조지방, 조단백질 및 무기질, 아미노산 조성을 보였으며, 항암활성 실험과 효소실험 결과, 세포독성이 비교적 낮았으며, 각종 암세포에 대한 저해 활성이 비교적 높았으며, 효소실험결과 비교적 높은 저해 율 을 보여 부산물을 이용한 식품 및 고단백 사료로의 활용.
○ 따라서, 원전 온배수를 그대로 해수미세조류 배양에 적극 활용함으로써, 저렴한 비용으로 바이오디젤의 대량 생산의 실용화가 가능하며, 더 나아가 에너지 절감, CO2 저감 효과, 바이오디젤 생산 후, 부산물의 동물 사료로의 활용을 통해 경제성 확보가 가능
적용분야
○ 원자력 발전소로부터 지금까지는 그냥 바다로 방출되는 폐자 원인 원전 온배수와 방출되는 이산화탄소를 이용해 해양 미세조류로부터 바이오 디젤 생산 즉시 실용화
○ 공정 부산물들을 고 단백 사료화로 만들 수 있는 핵심 기술을 보유하고 있어 저 에너지 투입을 통한 고 에너지 생산에 적용할 수 있으며, 이와 함께 모든 자원의 재 순환이 가능한 총체적 LCA (Life Cycle Accessment) system 을 구축
○ 또한, 원전 시설과 병행된 상업적 생산 규모의 해양 미세조류 배양 단지 구축을 통해 친환경 저탄소의 Eco-friendly Energy Farm에서 저가의 해양 바이오 에너지 생산을 통한 지상에서 에너지 생산을 통한 에너지 자립국의 기반을 조성
목차 Contents
- 최종보고서 제출서 ... 1
- 표지 ... 2
- 제출문 ... 3
- 보고서 초록 ... 4
- 주요 연구성과 ... 48
- 목차 ... 56
- 제1장 서론 ... 57
- 제1절 개발기술의 중요성 및 필요성 ... 57
- 제2절 국내·외 관련 기술의 현황 ... 62
- 제3절 예상되는 기술적·경제적 파급 효과 ... 71
- 제2장 내용 및 방법 ... 77
- 제1절 최종 목표 및 평가 방법 ... 77
- 제2절 단계 목표 및 평가 방법 ... 77
- 제3절 연차별 개발 내용 및 개발 범위 ... 78
- 제3장 결과 및 사업화 계획 ... 80
- 제1절 연구개발 최종 결과 ... 80
- 1. 연구개발 추진 일정 ... 80
- 2. 연구개발 추진 실적 ... 83
- 3. 결과의 유형 및 무형 성과 전체를 기재 ... 109
- 제2절 연구개발 추진 체계 ... 253
- 1. 각 기관/기업별 역할 및 추진내역 ... 253
- 제3절 시장현황 및 사업화 전망 ... 255
- 부록 ... 265
- 최종보고서 요약서 ... 283
- 사업성과 활용보고서 ... 287
- 세부 항목별 성과 ... 291
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