초록

III. 연구개발 내용 및 범위
- 지표종의 선정
- 선정한 지표종을 중금속에 실험적으로 노출시켜 중금속해독단백질인 metallothionein(MT) 발현을 기관별로 측정하고, MT 유전자 클로닝
- 지표종에 대한 중금속 결합물질 파악 및 유전자에 대한 단클론항체 개발
- 개발된 단클론항체를 이용한 중금속 노출 생물지표 활용성 확인
- 중금속 노출에 대한 세포 독성반응 평가

Abstract ▼

III. Content and scope of research and development
- Selection of indicator species and cloning of the metallothionein gene of the indicator species
- Identification of the matters of heavy metal coupling and the development of monoclonal antibodies for metallothionein genes
- Confirmation

III. Content and scope of research and development
- Selection of indicator species and cloning of the metallothionein gene of the indicator species
- Identification of the matters of heavy metal coupling and the development of monoclonal antibodies for metallothionein genes
- Confirmation of the utility of the biological index for heavy metal contamination using the monoclonal antibodies developed
- Evaluation of cellular response to toxicity for heavy metal contamination

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 4
• CONTENTS ... 7
• 목차 ... 10
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 12
• 1절 연구개발의 목표 ... 12
• 2절 연구개발의 필요성 ... 12
• 1. 기술적 측면 ... 13
• 가. MT 연구의 중요성 ... 13
• 나. 민감하고 저렴한 MT 측정법의 개발 ... 13
• 다. 상위 생물단계에서와의 관계성 검증 ... 13
• 2. 경제.산업적 측면 ... 14
• 가. 연안환경과 수산물 자원관리의 경제적 가치 ... 14
• 나. 단클론항체 개발 효과 ... 14
• 3. 사회.문화적 측면 ... 14
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 및 과학기술정보 ... 16
• 1절 국내.외 관련연구의 현황과 문제점 ... 16
• 1. 퇴적물 환경에 서식하는 생물 종에 관한 연구 부족 ... 16
• 2. 해양생물의 중금속 오염지표로서의 MT활용을 위한 분자생물학적 면역학적 방법 활용 미비 ... 16
• 2절 국내외 연구사례 ... 19
• 1 외국의 경우 ... 19
• 2. 국내의 경우 ... 19
• 3. 조사연구개발사례에 대한 평가 ... 20
• 3절 국.내외 기술수준 비교 ... 20
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 21
• 1절 연구수행 내용 ... 21
• 1. 수산패류의 중금속독성 평가법 개발에 적합한 지표종 및 부위 선정 ... 21
• 가. 지표종 선정 분석에 사용된 해산패류 ... 21
• 나. 시료의 채집 ... 21
• 다. Cd 노출 실험 ... 21
• 라. 시료의 해부 ... 21
• 마. 시료의 처리 ... 22
• 바. 중금속 농도의 측정 ... 22
• 2. 선택종의 중금속 결합물질 metallothionein 파악 및 특성 규명 ... 22
• 가. 바지락으로부터 metallothionein like protein(MTLP) 정제 ... 22
• 나. 바지락으로부터 Cd 노출에 대한 MT mRNA 발현량 변화 ... 23
• 다. 바지락으로부터 Cd 노출에 대한 proteomic 분석 ... 23
• 3. MT 유전자 cloning, 재조합 MT 단백질로부터 단클론 항체 개발 ... 24
• 가. 바지락 MT cloning ... 24
• 나. RNA extraction and RT-PCR ... 24
• 다. cDNA 합성 및 GST Fusion construct 제작 ... 26
• 라. IPTG 유도와 GST 융합 단백의 발현 ... 26
• 마. GST Fusion protein 정제 및 다클론 항체의 제작 ... 26
• 바. 다클론 항체제작 ... 26
• 4. Cd 노출에 따른 바지락 (Ruditapes philippinarum)의 세포 독성 측정 ... 27
• 가. 실험 개요 ... 27
• 나. 혈구사망률 (Hemocyte mortality) ... 27
• 다. DNA 손상도 ... 27
• 라. Apoptosis와 necrosis ... 28
• 마. 통계분석 ... 28
• 2절 연구수행 결과 ... 28
• 1. 수산패류의 중금속독성 평가법 개발에 적합한 지표종 및 부위 선정 ... 28
• 가. 주요 수산패류의 체내 중금속 농도 비교 ... 28
• 나. Cd 노출 실험 결과 ... 28
• 다. 중금속 독성평가법 개발에 적합한 지표종 선정 ... 34
• 2. 선택종의 중금속 결합물질 metallothionein 파악 및 특성 규명 ... 40
• 가. 겔 여과법을 이용한 MT의 분리 ... 40
• 나. 음이온 교환 크로마토그래피를 통한 MT 분리 ... 40
• 다. SDS-PAGE와 HPLC를 이용한 MT 확인 ... 40
• 라. Cd 노출에 대한 MT mRNA 발현량 변화 ... 45
• 마. Cd 노출에 대한 단백질체 분석 ... 45
• 3. MT 유전자 cloning, 재조합 MT 단백질로부터 단클론 항체 개발 ... 45
• 가. MT cloning ... 45
• 나. His tagged DHFR-MT의 클로닝 ... 54
• 다. 대장균을 이용한 재조합 MT발현 및 재조합 단백의 정제 ... 54
• 라. His-tagged DHFR MT fusion 단백을 이용한 Mouse Monoclonal Antibody의 제조 ... 61
• 마. GST-tagged Metallothionein fusion protein 합성을 위한 Metallothionein specific PCR 및 construct의 제조 ... 66
• 바. GST-Fusion Protein의 과발현 유도 및 정제 ... 67
• 사. GST-tag Fusion system을 이용한 Mouse monoclonal antibody의 제조 ... 70
• 아. Hybridoma cell line을 만들기 위한 GST-tag MT Monoclonal Ab screening ... 70
• 자. GST-tag Metallothionein Monoclonal Ab 제조 및 western analysis ... 70
• 차. N, C-terminal His-tag Fusion system을 이용한 Metallothionein construc의 제조 및 Bacterial cell display의 응용 ... 71
• 4. Cd 노출에 따른 바지락 (Ruditapes philippinarum)의 세포 독성 측정 ... 86
• 가. DNA 손상도 ... 86
• 나. Apoptosis와 necrosis ... 86
• 다. 혈구 Mortality ... 86
• 5. MT 단클론 항체 확립 ... 93
• 가. 단클론 항체의 생산 ... 95
• 나. 단클론 항체의 정제 및 HRP-conjugation ... 95
• 다. 단클론 항체 특이성 측정 ... 98
• 제 4 장 연구개발 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 106
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 108
• 제 6 장 참고문헌 ... 110