초록 ▼

I. 연구개발의 목적 및 필요성
청각 및 평형장애와 연관하여 행동이상을 보이는 자연발증적 돌연변이 마우스 (circling mouse)의 원인 유전자 (Tmie)의 기능을 분자적인 수준에서 연구함으로써 청각장애의 기전을 연구함. 또한 본 유전자의 human homologue 추적 연구에 의한 유전적인 청각장애의 메커니즘을 밝히고자 함.
II. 연구개발의 내용 및 범위
연구자들은 head-tossing과 circling 등의 행동 장애를 보이는 circling mouse를 발견하고 예비 실험을 통하여 이들이 상염색체

I. 연구개발의 목적 및 필요성
청각 및 평형장애와 연관하여 행동이상을 보이는 자연발증적 돌연변이 마우스 (circling mouse)의 원인 유전자 (Tmie)의 기능을 분자적인 수준에서 연구함으로써 청각장애의 기전을 연구함. 또한 본 유전자의 human homologue 추적 연구에 의한 유전적인 청각장애의 메커니즘을 밝히고자 함.
II. 연구개발의 내용 및 범위
연구자들은 head-tossing과 circling 등의 행동 장애를 보이는 circling mouse를 발견하고 예비 실험을 통하여 이들이 상염색체 열성 유전을 함을 확인하였음. 와우 내의 유모 세포의 퇴행과 이차적인 나선신경절 세포의 전반적 퇴행의 소견을 보여 유전자 결함에 의한 청력 손실의 가장 흔한 원인인 신경상피 결함을 관찰함. 청각테스트는 circling 마우스에서 완전한 청각손실을 나타내었음. 원인유전자(Tmie)의 특성을 정확히 파악하기 위하여 ① 내이 특이적 발현 프로모터 개발, ② 원인 유전자인 tmie와 상호작용 하는 단백질 검색, ③ 세포내의 tmie 위치 탐색, ④ tmie 발현 패턴 연구, ⑤ in vitro cell 실험에서의 tmie 기능 분석 등을 통하여 청력손실을 야기하는 유전자 연구에 독창적인 연구 자료를 확보한 상태에서 지속적 연구를 시행하고자 함. 본 유전자의 기능을 분자적인 수준에서 연구함으로써 청각장애의 기전을 연구함.
III. 연구개발결과
circling 마우스의 원인유전자인 tmie의 내이에서의 기능을 알아보기 위하여 myo7a promoter를 클로닝 하였으며 이를 이용하여 내이 특이적 발현을 위한 형질전환 벡터를 구축하였음. 이 벡터를 이용하여 형질전환 마우스를 생산하였으나 내이의 inner와 outer hair cell에서만 발현할 경우 표현형의 회복을 보이지 않았음. circling 마우스의 원인 유전자의 기능을 알아보기 위하여 상호작용하는 단백질 탐색의 연구에 yeast two hybrid screening을 사용하였음. 3가지의 library에서 유효한 후보 단백질을 발견하지 못하였음. 세포내의 위치 탐색을 위하여 원인 유전자를 내이 유래의 세포주에 transfection하고 발현의 위치를 Golgi와 ER의 marker protein을 이용하여 알아봄. tmie 단백질은 ER에서 위치하고 있음. 정상 마우스의 경우 생후 14일경까지 내이의 발달이 이뤄지므로 이 시기의 tmie 단백질의 기능을 알아보기 위하여 성장시기 별로 내이에서의 위치와 발현양을 알아봄. tmie 단백질은 마우스의 성장에 따라 점차적으로 많은 양을 발현하였으며, 핵을 제외한 세포질에서 발현하였음. FM1-43 dye를 이용하여 stereocilia의 기능이 제대로 이루어지고 있는지를 알아보기 위하여 circling 마우스가 hair cell을 잃기 전인 postnatal day 2-3에 정상 마우스와 circling 마우스의 내이 explant를 배양함. FM1-43 염색 결과, 정상 마우스는 FM1-43 염색체에 의해 apex, middle, 그리고 base turn에 있는 hair cell이 염색이 됨. 그러나 circling 마우스에서는 전혀 염색이 되지 않음을 알 수 있음.
IV. 연구개발결과의 활용계획
청신경에서의 기능을 알아보기 위하여 신경에 특이적으로 발현하도록 유도한 형질전환 마우스를 생산하여 표현형의 회복을 알아봄으로써 tmie 단백질의 기능이 어떤 조직에서 중요한 것인지를 알아 볼 수 있음. 이 형질전환 마우스도 본 연구 결과에서처럼 역교배를 통하여 형질전환 유전자를 가지는circling 마우스를 생산하고 이 마우스에서의 표현형의 회복의 정도를 파악함. 세포내 발현 위치를 파악함으로써 원인 유전자의 기능을 유추해 볼 수 있음. 정확한 기능을 밝히기 위하여 다각도의 연구가 필요할 것으로 사료됨. 원인 유전자의 발현 시기와 발현양의 연구를 통하여 발달 단계에서의 기능을 알아볼 수 있음.

Abstract ▼

I. Purpose
We proposed the functional analysis of the causative gene of the circling mouse in a molecular leve l and the mechanisms of the de velopment of the hearing loss. We also propose d the mechanisms of hearing loss of circling mouse by tracing the human homologue.
II. Research contents<

I. Purpose
We proposed the functional analysis of the causative gene of the circling mouse in a molecular leve l and the mechanisms of the de velopment of the hearing loss. We also propose d the mechanisms of hearing loss of circling mouse by tracing the human homologue.
II. Research contents
Previously, we studied the circling mouse showing head-tossing, circling and hearing loss and the circling gene (cir) mutation is transmitted by an autosomal recessive gene. The most notable pathological findings in these mice are the almost completely degenerated cochlea and the remarkably reduced cellularity in the spiral limbus; hearing loss can be clearly demonstrated using auditory tests. In this study, we researched ① development of the inner ear-specific promoter, ② screening the interacting partners with tmie protein, ③ subcellular localization of tmie protein, ④ tmie expression patterns, and ⑤ functional analysis of tmie in vitro in order to find out to characterize the causative gene. We performed a functional analysis of Tmie at the protein level for the research of the the mechanisms of hearing loss of circling mouse.
III. Results
In order to analyze the function of tmie protein, we developed the inner ear-specific promoter and produced the circling homozygous mice with transgene. Transfer of the tmie gene into homozygous circling mice through inner ear-specific transgenesis using the Myo7A promoter does not ameliorate the hearing and behavior phenotypes, implying that the tmie gene is required not only in hair cells but in other types of cochlear cells, including supporting cells and spiral ganglion neurons. In order to identify partners interacting with Tmie, we have performed a yeast two-hybrid screen using the C-terminal 74 amino acids of mouse Tmie as a bait to screen 3 different libraries. We were not able to isolate a Tmie-interacting partner from any of these libraries. In HEI-OC1 auditory cells, Tmie protein is coexpressed with the endoplasmic reticulum marker protein Calnexin. Mouse inner ear develops and maturates until postnatal 14 days. Mouse tmie expression in early postnatal life is prominent in the stereociliary bundles and the cytoplasm of hair cells and is getting stronger as the mouse grows up. Hair cells in mouse cochlear cultures are selectively labeled by brief exposure to FM1-43, a styryl dye used to study endocytosis and exocytosis. Normal mouse hair cells were stained by FM1-42 but circling mouse hair cells did not show any positive signals in three turns of the cochlea. This means the stereocilia of circling mouse at early postnatal days do not function as normal.
IV. Expected contribution and application
In a transgenic way, we are planning the neuron-specific promoter development, and producing the transgenic mice for the phenotypic rescue. Backcross breeding strategy and observation of the rescue levels are needed. Subcellular localization can help study the functions of the causative gene. We can predict the functions of the causative gene through the studies about spatiotemporal expression patterns.

목차 Contents

• I. 총괄현황 ... 1
• 1. 표지 ... 2
• 2. 제출문 ... 4
• 3. 보고서 요약서 ... 5
• 4. 요약문 (한글) ... 6
• 5. 요약문 (영문) ... 8
• 6. 연구 성과 실적 및 향후 계획 ... 10
• 7. 참여연구원 현황표 ... 14
• II. 총괄연구과제 연구결과 ... 15
• 1. 연구개발과제의 배경 및 필요성 ... 16
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 19
• 3. 연구개발과제의 추진체계 ... 21
• 4. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 23
• 5. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 41
• 6. 향후 연구성과 추진 계획 ... 42
• 7. 연구개발결과의 파급효과 ... 42
• 8. 연구개발결과의 활용계획 ... 44
• 9. 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 45
• 10. 참고문헌 ... 45