보고서 정보
주관연구기관 |
서울대학교 산학협력단 |
연구책임자 |
유상렬
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참여연구자 |
신학동
,
황선영
,
박재은
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보고서유형 | 최종보고서 |
발행국가 | 대한민국 |
언어 |
한국어
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발행년월 | 2011-04 |
과제시작연도 |
2010 |
주관부처 |
보건복지부 |
사업 관리 기관 |
한국보건산업진흥원 Korea Health Industry Development Institute |
등록번호 |
TRKO201300028477 |
과제고유번호 |
1355061274 |
사업명 |
보건의료기술연구개발 |
DB 구축일자 |
2013-09-14
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키워드 |
캠필로박터.유전자 발현.독성 유전자.시그마인자.스트레스 저항성.Campylobacter.gene expression.virulence gene.sigma factor.stress resistance.
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초록
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I. 연구개발의 목적 및 필요성
캠필로박터 rpoN 유전자의 발현 특성규명 및 관련 독성유전자 조절 기작 규명 및 캠필로박터의 감염 예방 및 제어, 치료법 개발에 응용
II. 연구개발의 내용 및 결과
1) 균체 내의 RpoN의 기능, 특성 규명 및 발현 조절 환경인자 탐색
○ 캠필로박터 RpoN은 헬리코박터 RpoN과 약 47% identity를 가지며, log phase에서 최대 발현 양상을 가짐.
○ RpoN 결여 시, flagella 손실에 의한 운동성 감소 및 biofilm formation, au
I. 연구개발의 목적 및 필요성
캠필로박터 rpoN 유전자의 발현 특성규명 및 관련 독성유전자 조절 기작 규명 및 캠필로박터의 감염 예방 및 제어, 치료법 개발에 응용
II. 연구개발의 내용 및 결과
1) 균체 내의 RpoN의 기능, 특성 규명 및 발현 조절 환경인자 탐색
○ 캠필로박터 RpoN은 헬리코박터 RpoN과 약 47% identity를 가지며, log phase에서 최대 발현 양상을 가짐.
○ RpoN 결여 시, flagella 손실에 의한 운동성 감소 및 biofilm formation, autoagglutination ability가 감소됨. 이는 동물세포로의 invasion ability 감소를 초래.
○ Human serum, 항상제에 대한 저항성에는 관여하지 않음.
○ 환경 스트레스에 대한 저항성 테스트 결과, rpoN 돌연변이 시 0.8% 이상의 염 농도 하에서 확연한 성장 저해를 보이며, 비정상적으로 길어진 이상 형태를 보임. 저온 및 열처리에 대해서는 약간의 저항성이 증가를 나타냄, 그러나 산화적 스트레스와 pH 변화에 대해 감수성이 증가함.
○ 실험실 규모의 세척 공정에서 rpoN 결여 시, 생존 균수가 현저히 감소함.
○ Static culture condition 조건 하에서 rpoN 돌연변이 균주는 야생 균주에 비해 현저한 성장 저해가 일어나며, 균체 길이가 5~10배 늘어나거나 또는 cocci 형의 균체로 변함.
2) RpoN 의존적 하위 유전자 탐색 및 동정
○ Proteome analysis를 통해 RpoN 최대발현 조건에서 rpoN -의존적 발현양상을 보이는 유전자들을 동정함.
○ Proteome analysis를 통해 static culture condition 하에서의 rpoN -의존적 발현양상을 보이는 유전자들을 탐색함.
3) RpoN 의존적 병원성 유전자의 특성 규명 및 관련 유전자 탐색
○ RpoN 최대발현 조건에서 RpoN regulon으로 예측되는 유전자들를 genome database search와 invasion assay를 통해, 타깃 하위 유전자를 선별함. 선별된 유전자는 CJJ81176_1418로 methyltransferase를 암호화하며, CPS biosynthesis gene cluster region에 위치함.
○ gene-knockout 방법을 통해 구축된 CJJ81176_1418 돌연변이는 야생균주와 비슷한 성장곡선과 형태를 가짐. 그러나 야생균주와 비교하여 약 80% 감소한 invasion ability를 가짐.
○ CPS analysis를 통해 CJJ81176_1419, CJJ81176_1418은 rpoN 돌연변이 균주와 비슷하게 분자량이 커진 polysacchacide를 생성함. 그러나 CJJ81176_1417의 경우 CPS 손실됨.
○ rpoN 결여에 따라 현저한 성장 저해와 이상 형태의 cocci fo rm 균체가 형성된 static culture condition하에서 proteomic analysis를 통해, rpoN에 의해 발현이 조절 될 것으로 여겨지는 유전자 (ftsA, porA, ackA,rbr 등)를 동정함. 동정된 유전자들은 cell outer membrane, cell division, 또는 stationary, stress 조건하에서 중요한 유전자들임.
4) RpoN과 하위 유전자에 의한 병원성 조절 기전 규명
○ CPS는 Campylobacter의 중요한 병원성 인자로써, 스트레스 저항성과도 직접적으로 연관됨. 연구 결과를 통해 RpoN은 직, 간접적으로 CJJ81176_1419~1417의 발현을 조절하여 CPS 생합성에 관여하는 것으로 보이며, 이러한 조절 메커니즘은 결과적으로 Campylobacter 스트레스 저항성에 영향을 미칠 수 있는 중요한 기전으로 여겨짐.
○ Static culture condition상에서 rpoN 결여가 FtsA의 증가를 야기함. FtsA는 cell division을 억제하는 요소로써, 발현이 증가됨에 따라 길이가 늘어난 이상형태의 균이 늘어남을 알 수 있음. 또한 rpoN 결여 시, 주된 outer membrane protien인 MOMP, PorA의 발현감소는 실제 cell division이 원활하게 일어나지 않음을 직접 또는 간접적으로 보여주는 결과라 여겨짐. RpoN이 없을 경우, 산소공급이 제한된 환경에서 캠필로박터의 stationary phase에서의 생장에 주된 작용을 하는 AcKA가 upregulation 되고, 이는 acetate pathway의 비정상적인 작용 야기, cell division 이상을 초래하여, 결과적으로 아직까지 생성 기작이 잘 알려지지 않은 VBNC form으로의 변화를 촉진시키게 되는 것으로 판단됨.
○ 결과를 바탕으로, RpoN은 다양한 환경 스트레스 하에서의 Campylobacter의 생존 및 병원성에 관여함을 밝힘.
III. 연구개발결과의 활용계획
1) 연구개발 내용의 활용
○ 국제적 경쟁력 구축과 연구 인력 양성 (석사 1, 박사 1)
○ 감염 세균연구의 model system 제시 및 보건, 의약산업으로 기술 이전 (SCI 논문 2편 submission)
2) 기대효과
○ 병원균의 생존 기작과 인체 내 발병 기전에 대한 이해 증진
○ 새로운 패러다임의 감염 세균 치료 및 제어 방안 개발 통한 보건의료산업 경쟁력 향상
○ 병원균 오염 방지 및 감염에 대한 초기 예방에 따른 부가가치 상승
Abstract
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I. Purpose
○ To characterize the regulation and the survival mechanism regulated by rpoN in C. jejuni, and to suggest the target genes to control pathogenic bacteria and provide the theoretical basis for prevention and remedy of Campylobacter infection.
II. Contents and results
1) Examinati
I. Purpose
○ To characterize the regulation and the survival mechanism regulated by rpoN in C. jejuni, and to suggest the target genes to control pathogenic bacteria and provide the theoretical basis for prevention and remedy of Campylobacter infection.
II. Contents and results
1) Examination of the function and expression of RpoN in C. jejuni
○ 47% identical to that of H. pylori, and the highest transcriptional expression in log phase.
○ The rpoN mutation caused the loss of flagella and subsequent motility. Biofilm formation and autoagglutination were significantly reduced, which resulted in the reduction of invasion ability.
○ The rpoN mutation did not affect the resistance of C. jejuni to human sera, and antibiotics.
○ The rpoN mutation resulted in the significant growth defect and caused the abnormally elongated cellular morphological change in the presence of high concentration of NaCl (>0.8%).
The rpoN mutant showed higher resistance to cold and heat shock compared with the wild type, while it showed slightly lower resistance to oxdative stress and pH changes.
○ The rpoN mutant was washed away from chicken skin more easily compared with the wild type.
○ Also the significant growth defect and abnormal morphological changes was observed in the rpoN mutant when the bacteria were grown statically.
2) Identification of RpoN regulons
○ The RpoN regulons in log phase under shaking culture condition or in stationary phase under static culture condition were identified through the proteomic analysis using 2D-GE.
3) Characterization of the genes regulated by RpoN
○ CJJ81176_1419~1417 operon encoding the methyltransferases located in the region of CPS biosynthesis gene cluster was selected for further study.
○ CJJ81176_1418 mutant showed a similar growth rate and morphology to wild type, but reduced invasion ability.
○ Consistent with the rpoN mutation, both the CJJ81176_1419 mutant and the CJJ81176_1418 mutant caused the increased molecular weight of CPS, but CJJ81176_1417 showed the loss of CPS.
○ Another RpoN regulons under static culture condition included FtsA, AckA, and Rbr, which were involved in cell outer membrane, cell division, and the survival in stationary phase or stress condition, respectively.
4) Verification of the virulence mechanism regulated by RpoN and its regulons in C. jejuni
○ Based on our results, RpoN might be involved in CPS biosynthesis by regulating the expression of CJJ81176_1419~1417 operon directly or indirectly. The regulation was ultimately considered as an important mechanism in Campylobacter stress resistance.
○ Under static culture condition, the rpoN mutation caused the increased expression of FtsA, a cell division inhibition factor, which resulted in the abnormally elongated cellular morphological change. The reduced expression of PorA, the major outer membrane protein, also could explain the abnormal cell division. Under oxygen limited condition, the rpoN mutation caused the upregulation of AckA resulting in the aberrant acetate pathway and the abnormal cell division, which might cause the VBNC formation of C. jejuni.
○ These results suggest that RpoN is involved in the survival and virulence mechanisms of C. jejuni in various conditions.
IV. Expectations.
1) The application of the study
○ Strengthening global competitiveness and training researchs (education; one Master and one Doctor)
○ Suggesting the novel stress resistance mechanism of infective bacteria (expecting two publications in SCI journals)
2) The expected effect
○ understanding the virulence and survival mechanism of pathogens
○ Improving the competitiveness in the health & medic industry through suggestion of the novel paradigm of the remedy and developing control method against bacterial infection
○ Improving the value of the commodities by lowering infective bacterial contamination and infection through early prevention
목차 Contents
- I. 총괄현황 ... 1
- 1. 표지 ... 2
- 2. 제출문 ... 4
- 3. 보고서 요약서 ... 5
- 4. 요약문 (한글) ... 6
- 5. 요약문 (영문) ... 8
- 6. 연구 성과 실적 및 향후 계획 ... 10
- 7. 참여연구원 현황표 ... 14
- II. 총괄연구과제 연구결과 ... 15
- 1. 연구개발과제의 배경 및 필요성 ... 16
- 2. 국내외 기술개발 현황 ... 19
- 3. 연구개발과제의 추진체계 ... 22
- 4. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 23
- 5. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 40
- 6. 향후 연구성과 추진 계획 ... 41
- 7. 연구개발결과의 파급효과 ... 42
- 8. 연구개발결과의 활용계획 ... 43
- 9. 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 44
- 10. 참고문헌 ... 44
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