초록 ▼

I. 연구개발의 목적 및 필요성
(1) 난소암은 조기진단이 어렵고 재발율이 높은 치명적인 부인암
(2) 암전이율이 높은 난소암 치료에 적용할 수 있는 획기적인 표적항암제 개발이 필요함.
(3) 난소암은 기존항암제와 방사선치료 등에 내성을 보이며 새로운 표적항암제 개발에 대한 원천적인 기초연구개발이 절실함.
(4) BCL-2 종양단백질이 베클린1에 의한 자식작용을 억제하며 세포사멸을 억제함.
(5) 자식작용을 이용한 세포사멸유도가 선택적인 암세포의 사멸과 기존항암제의 활성을 조절하고 항암제의 내성극복의 새로

I. 연구개발의 목적 및 필요성
(1) 난소암은 조기진단이 어렵고 재발율이 높은 치명적인 부인암
(2) 암전이율이 높은 난소암 치료에 적용할 수 있는 획기적인 표적항암제 개발이 필요함.
(3) 난소암은 기존항암제와 방사선치료 등에 내성을 보이며 새로운 표적항암제 개발에 대한 원천적인 기초연구개발이 절실함.
(4) BCL-2 종양단백질이 베클린1에 의한 자식작용을 억제하며 세포사멸을 억제함.
(5) 자식작용을 이용한 세포사멸유도가 선택적인 암세포의 사멸과 기존항암제의 활성을 조절하고 항암제의 내성극복의 새로운 패러다임 제공하므로 자식작용을 조절하는 후보물질의 발굴 및 기전연구가 난소암 표적치료소재 개발연구에 중요함
(6) 자식작용을 이용한 난소암 치료소재 발굴과 개발이 혁신적인 치료소재 발굴에 기여할 수 있음.
(7) 난소암에서 발현이 억제된 mD3유전자의 새로운 종양억제기능을 밝히고, mD3의 종양억제기전과 세포내 신호전달 규명을 통한 난소암 표적치료소재 개발이 필요함.
II. 연구개발의 내용 및 범위
1 난소암에서 발현이 억제된 mD3의 새로운 종양억제 기능 규명
(1) Flag로 tagging 되어 추적이 용이한 Flag-mD3 과발현 인체세포주 수립
(2) mD3 과발현과 siRNA를 통한 mD3 발현간섭을 이용한 mD3의 종양억제 기능 연구
(3) mD3발현이 세포증식, 신생혈관생성, 세포사멸과 자식작용에 미치는 영향 연구
(4) mD3 과발현세포주를 이용한 mD3 타겟 유전자 탐색 및 발현 검증
2. mD3의 종양억제 분자기전 연구
(1) 이스트 하이브리드 스크리닝을 통한 mD3 결합단백질 발굴 및 결합도메인 멥핑연구
(2) mD3 결합단백질 과발현 인체세포주 수립을 통한 mD3 의 종양억제 기능연구
(3) mD3 자식작용 조절 분자기전과 신호전달 연구
III. 연구개발결과
<1차년도: mD3 유전자의 자식작용 유도 기능과 작용기전 규명>
(1) mD3의 발현이 감소되어 있는 인체 암세포에 과발현시 자식작용이 유도되며, 암세포의 증식이 억제되고 세포사멸이 유도됨. (2) 생리적농도에서의 mD3 기능연구를 위하여, mD3 과발현 인체 정상세포주 및 인체 난소암세포주 수립. (3) mD3과발현시 자식작용에 중요한 autophagosome형성을 증가됨 (4) mD3과발현 세포주를 이용한 마이크로어레이 분석을 통하여 mD3 타겟 유전자 발굴 (5) mD3가 베클린1단백질과 직접 상호작용함을 발견. (6) 베클린단백질의 알려진 단백질도메인을 발현하는 발현벡터를 제조하여 도메인 mapping 연구를 통해 베클린1단백질의 BD도메인이 mD3단백질과 결합함을 밝힘. (8) mD3단백질이BCL-2 단백질과 베클린 1 단백질의 결합을 억제하여 BCL-2단백질의 기능을 억제하여 자식작용을 유도할 수 있음을 밝힘. (9) 이스트2-hybrid 스크리닝 을 통하여 mD3 결합 후보단백질 동정.
<2차년도: mD3의 세포막 후보수용체 동정 및 종양억제 기전과 신호전달 규명>
(1) 이스트 투 하이브리드 스크리닝을 통해 동정된 mC1단백질이 세포막에 위치함을 확인. (2) mC1 과발현 인체세포주 수립 (3) 정상 난소조직과 난소암 조직의TMA 블록을 준비하여 면역조직화학염색을 수행하여 mC1 단백질의 발현이 인체 정상난소조직에 비해 난소암조직에서 현저히 증가되어 있음을 확인 (4) mD3의 난소암세포 증식억제가 mC1에 의존하여 일어남을 확인 (5) mD3 과발현 세포 수립 후 cDNA 마이크로어레이 분석을 통해, KAI-1, MMP2, MMP9 등의 mRNA 발현이 억제됨을 발견 (6) mD3처리시 암세포의 침윤과 신생혈관생성이 억제됨 (7) 재조합 mD3단백질 처리시 혈관신생형성 억제함 (8) mD3에 의한 난소암세포의 세포증식 억제가 mC1단백질에 의존적임. (9) mD3 과발현에 의해 세포증식에 중요한 RAS-RAF-ERK 신호전달이 억제되며, 엠톨 단백질의 인산화가 억제됨
IV. 연구개발결과의 활용계획
(1) mD3의 혈관신생억제기능을 이용한 암전이를 억제하는 항암치료소재 개발에 활용
(2) 베클린1 과mD3 상호작용을 이용한 BCL-2 억제 물질 스크리닝에 활용
(3) mD3를 이용한 펩타이드 난소암 치료제 개발에 활용
(4) mD3 후보막단백질인 mC1에 대한 항체개발을 통한 치료항체개발에 활용
(5) 기존항암제의 내성과 독성을 극복하며 효과를 증진시킬 수 있는 병합항암치료제 연구에 활용
(6) mD3 특허등록을 통한 지적재산권확보
(7) 다양한 고형암의 항암 치료소재로서의 mD3 탐색연구에 활용

Abstract ▼

Ovarian cancer is one of the most lethal gynecologic malignancies with one of the worst prognoses. mD3 is a member of a gene family encoding secreted glycoproteins that regulate cell fate during embryonic development. Our previous results showed the marked reduction of mD3 in human ovarian cancer co

Ovarian cancer is one of the most lethal gynecologic malignancies with one of the worst prognoses. mD3 is a member of a gene family encoding secreted glycoproteins that regulate cell fate during embryonic development. Our previous results showed the marked reduction of mD3 in human ovarian cancer compared with its normal counterpart. To explore novel functions of mD3 in ovarian cancer and to investigate its underlying molecular mechanisms, we set out to explore its functions in autophagy. To address the role of mD3 in autophagy, autophagy protein induction, autophagosome formation and Beclin 1-Vps34 complex formation were assessed by immunoblotting, immunoprecipitation, immunofluorescence microscopy and TEM analyses. We discovered a novel function of mD3 in the induction of autophagy. Ectopic expression of mD3 in human ovarian cancer cells induced the expression of endogenous autophagy proteins and enhanced autophagosome formation, which is central to the autophagy process. Conversely, siRNA-mediated silencing of mD3 expression in normal human fibroblasts suppressed mD3-mediated autophagy protein induction. Expression of anti-apoptotic Bcl-2 protein has been reported to be aberrantly upregulated in human cancer, and Bcl-2 inhibits Beclin 1-dependent autophagy and Beclin 1-dependent autophagic cell death via interaction with the BD domain of Beclin 1. Interestingly, we observed that forced overexpression of mD3 interfered with the Beclin 1-Bcl-2 interaction and markedly inhibited the expression of Bcl-2 protein. A further mapping study indicated that mD3 binds to the BD domain of Beclin 1 and the interaction abrogated endogenous Beclin 1-Bcl-2 complex formation, which is important for inhibition of autophagosome formation. Our results provide a very attractive model. First, mD3 exerted a positive impact on autophagy by inducing autophagosome formation, whereas mD3 inhibited a negative impact on autophagy by inhibiting the level of Bcl-2 protein as well as by interfering with the interaction between Bcl-2 and Beclin 1. Furthermore, ectopic expression of mD3 inhibits the PI3K class I - mTOR signaling pathway but activates the PI3K class III signaling pathway, thereby resulting in the induction of autophagy. In conclusion, we have identified mD3 as a novel binding partner of the mammalian autophagy protein Beclin 1, and we suggest a tumor suppression mechanism through its interference with the Beclin 1-Bcl-2 interaction and subsequent induction of autophagic cell death and inhibition of ovarian cancer cell growth. Taken together, our findings provide a new avenue for a cancer therapeutic strategy by autophagy induction, which is commonly deregulated in human cancers. The induction of autophagy is thus a promising strategy for anticancer therapy of apoptosis-resistant cancers including ovarian cancer.

목차 Contents

• I. 총괄현황 ... 1
• 1. 표지 ... 2
• 2. 제출문 ... 3
• 3. 보고서 요약서 ... 4
• 4. 요약문 (한글) ... 6
• 5. 요약문 (영문) ... 8
• 6. 연구 성과 실적 및 향후 계획 ... 10
• 7. 참여연구원 현황표 ... 14
• II. 총괄연구과제 연구결과 ... 15
• 1. 연구개발과제의 배경 및 필요성 ... 16
• 2. 목표 및 내용 ... 19
• 3. 연구개발과제의 추진체계 ... 23
• 4. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 25
• 5. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 41
• 6. 향후 연구성과 추진 계획 ... 43
• 7. 연구개발결과의 파급효과 ... 43
• 8. 연구개발결과의 활용계획 ... 44
• 9. 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 44
• 10. 참고문헌 ... 44
• 최종보고서 비공개 승인요청서 ... 47