초록 ▼

I. 연구개발의 목적
HCV가 감염된 세포에서만 HCV genome을 표적하는 siRNA 활성을 유도함으로써 HCV 복제를 효과적이며 특이적으로 제어할 수 있는 유전산물을 개발하고자 함. 이를 위하여 HCV 표적 siRNA sequence를 HCV NS5B가 존재하여야만 생성할 수 있는 NS5B 의존성 allosteric ribozyme (sirtazyme)을 개발하고 개발된 항 HCV 제제에 의해 HCV 증식이 효과적이며 특이적으로 억제되는지 검증하고자 함.
II. 연구개발의 내용 및 범위
(1) reporter

I. 연구개발의 목적
HCV가 감염된 세포에서만 HCV genome을 표적하는 siRNA 활성을 유도함으로써 HCV 복제를 효과적이며 특이적으로 제어할 수 있는 유전산물을 개발하고자 함. 이를 위하여 HCV 표적 siRNA sequence를 HCV NS5B가 존재하여야만 생성할 수 있는 NS5B 의존성 allosteric ribozyme (sirtazyme)을 개발하고 개발된 항 HCV 제제에 의해 HCV 증식이 효과적이며 특이적으로 억제되는지 검증하고자 함.
II. 연구개발의 내용 및 범위
(1) reporter 표적 sirtazyme 제작 및 기능 분석을 통한 최적 sirtazyme 선별
- reporter 표적 sirtazyme 제작 및 실험관 내 NS5B와의 특이적 반응, kinetics 관찰
- sirtazyme에 의한 세포 내에서의 NS5B 의존성 reporter 활성 억제도 검증
(2) HCV 표적 sirtazyme 제작 및 기능 분석
- HCV 표적 sirtazyme 제작 및 실험관 내 NS5B와의 특이적 반응, kinetics 관찰
- sirtazyme에 의한 HCV replicon 세포에서의 HCV 증식 억제 관찰
(3) HCV 표적 sirtazyme 발현 아데노바이러스 벡터 제조
- sirtazyme을 HCV replicon 세포로 전달할 수 있는 바이러스 벡터 제조
- 세포 내 sirtazyme 발현도 관찰 및 NS5B 특이적 siRNA release 검증
(4) sirtazyme에 의한 HCV replicon 복제 억제 검증
- sirtazyme 바이러스 벡터에 의한 HCV replicon의 복제 억제 관찰
- sirtazyme 바이러스 벡터 도입에 의한 gene expression profile 관찰
III. 연구개발결과
(1) Reporter 표적 sirtazyme을 제작하였으며 sirtazyme은 NS5B 의존적으로 self-cleavage 활성이 효과적으로 유도됨으로써 NS5B가 존재시에만 우리가 원하는 siRNA의 단선 sequence를 release할 수 있음.
(2) Reporter 표적 sirtazyme을 발현할 수 있는 벡터를 제조하였으며 siRNA의 sense 및 antisense를 release할 수 있는 두 개의 vector를 cotransfection하는 경우에서만 HCV replicon cell 특이적으로 reporter 유전자 활성을 저해함.
(3) HCV 표적 siRNA 중 NS5B의 특정 부위를 표적하는 siRNA가 RNA 간섭현상 및 HCV 복제억제능이 가장 뛰어났으며 이러한 siRNA를 함유한 HCV 표적 sirtazyme을 제작함. sirtazyme은 NS5B 단백질 의존적으로 ribozyme 활성이 유도되어 HCV 표적 siRNA의 단선 sequence를 release할 수 있음.
(4) HCV 표적 sirtazyme을 발현할 수 있는 벡터를 제조하였으며 siRNA의 sense 및 antisense를 release할 수 있는 두 개의 vector를 cotransfection하는 경우, HCV replicon cell에서 특이적으로 HCV genome을 표적하는 siRNA의 활성을 유도하여 효과적으로 HCV RNA 복제를 저해함.
(5) HCV 표적 siRNA에 의한 HCV replicon 복제 억제는 비특이적인 세포 선천성 면역관련 유전자 발현 유도에 의한 것이 아니라 정확하게 HCV genome 표적 부위를 표적 후 절단하는 RNA 간섭현상에 의함. HCV 표적 siRNA의 HCV 복제 억제 효능 및 기전연구에 대한 결과내용을 Biotechnology Letters'에 투고하여 최근 게재가 승인됨.
(6) siRNA의 sense 및 antisense를 release할 수 있는 두 개의 sirtazyme vector를 tandem으로 삽입함으로써 HCV 표적 sirtazyme 발현 벡터를 간세포에 효율적으로 전달할 수 있는 adenoviral vector를 제작함.
(7) Sirtazyme을 발현하는 adenoviral vector를 세포에 도입시 HCV replicon이 복제하고 있는 세포에서만 특이적으로 siRNA release가 유도됨.
(8) 세포로 sirtazyme을 전달하여 발현할 수 있는 adenoviral 벡터에 의해 HCV 감염된 세포에서 특이적으로 HCV genome을 표적하는 siRNA 활성이 유도되어 HCV 복제가 억제됨.
(9) sirtazyme 바이러스 벡터를 세포에 도입 후 gene expression profile을 관찰한 결과 control 벡터와 비교시 거의 차이가 없음. 즉 sirtazyme의 경우 HCV가 감염되지 않은 정상 간세포에선 siRNA 활성이 유도되지 않아 비특이적 host 유전자 발현 패턴 변이가 최소화됨.
IV. 연구개발결과의 활용계획
- HCV 복제를 보다 효과적이며 특이적으로 억제할 수 있는 신개념 항 HCV 선도물질로 활용
- HCV 진단 제제 및 항 HCV 제제 스크리닝용 제제로 활용
- sirtazyme의 개념은 여러 질환의 특이적, 효과적인 치료 제제 개발연구에 범용으로 활용
- RNA dynamics의 구조적 특성 이해, nature 상태의 riboswitch 시스템 기전 연구에 활용
- sirtazyme은 지적 재산화할 예정이며 향 후 기업체로의 기술이전 및 공동연구를 통하여 전임상 및 임상실험을 위한 항 HCV 치료제로서 실용화 및 상용화를 모색함. 이를 위하여 효과적이며 비독성인 간으로의 nonviral sirtazyme delivery system 개발, 동물모델에서의 약동력학, HCV 억제 효능 및 안전성 등의 추가 연구 수행을 계획하고 있음.

Abstract ▼

I. Purpose
The goal of this project is to develop genetic material which can effectively suppress HCV replication through specific induction of HCV-targeting siRNA activity only in HCV-infected cells. To this end, we developed HCV NS5B-dependent allosteric ribozyme, sirtazyme, which specifically

I. Purpose
The goal of this project is to develop genetic material which can effectively suppress HCV replication through specific induction of HCV-targeting siRNA activity only in HCV-infected cells. To this end, we developed HCV NS5B-dependent allosteric ribozyme, sirtazyme, which specifically can release HCV targeting siRNA only in the presence of HCV NS5B and tested if the sirtazyme can specifically and efficiently inhibit HCV replication.
II. Contents and Scope of the project
-Construction of reporter-targeting sirtazyme and optimization of the sirtazyme through characterization of its functions
-Construction of HCV-targeting sirtazyme and characterization of its anti-HCV function
-Construction and characterization of sirtazyme-expressing adenoviral vectors
-Inhibition study of HCV replicon replication in cells infected with sirtazyme-expressing viral vector
III. Results of the project
-We constructed reporter-targeting sirtazyme. The sirtazyme can release single-stranded sequence of siRNA only in the presence of NS5B through specific and NS5B-dependent induction of self-cleavage activity.
-We constructed expression vectors for the sirtazyme. HCV-specific inhibition of reporter gene activity was observed only in the case of cotransfection of two sirtazyme-expression vectors which can release sense or antisense sequence of siRNA.
-siRNA which can target a specific region of HCV NS5B was best in terms of RNA interference and anti-HCV activity among various siRNAs. We constructed HCV-targeting sirtazyme which harbored the NS5B-specific siRNA. The sirtazyme can release single-stranded sequence of siRNA only in the presence of NS5B.
-We constructed expression vectors for the HCV-targeting sirtazyme. Inhibition of HCV replicon replication was observed only in the case of cotransfection of two sirtazyme-expression vectors which can release sense or antisense sequence of siRNA.
-HCV replication inhibition by HCV-targeting specific siRNA was not due to nonspecific induction of cellular innate immune gene response but mainly due to the specific and accurate RNA cleavage phenomena through RNA interference. We submitted an article covering the anti-HCV activity and mechanism of the HCV-targeting siRNA and the article was recently accepted in 'Biotechnology Letters'.
-We constructed adenoviral vector which can efficiently deliver the sirtazyme-expressing vector into liver cells through insertion of two sirtazyme vectors in tandem that can release sense or antisense sequence of the HCV-targeting siRNA.
-We observed specific siRNA release only in HCV replicon cells when introduced with the sirtazyme-expressing adenoviral vector.
-Inhibition of HCV replicon replication occurred in cells infected with the sirtazyme-expressing adenoviral vector through HCV-specific induction of activity of HCV genome-targeting siRNA.
-No big differences in gene expression profile was observed between cells infected with sirtazyme-adenoviral vector and control vector. In other words, sirtazyme caused minimal change in the gene expression pattern in normal liver cells because of no induction of siRNA activity in those cells.
IV. Expected contribution of the results
-To apply as anti-HCV lead compounds which can more specifically and effectively inhibit HCV replication.
-To apply as tools for the HTS screening of anti-HCV agents and biosensors for HCV detection.
-To apply for the development of agents which can modulate diverse incurable human diseases based on the concept of the specific activation of RNA interference
-To apply for structural characterization of RNA dynamics and studies on the mechanism of natural riboswitch system.
-To apply pate nt with the anti-HCV sirtazyme, and to perform additional experiments of development of nonviral delivery system of the sirtazyme, pharmacokinetics and pharmacodynamics of the sirtazyme in vivo, anti-HCV efficacy and toxicity by the sirtazyme in HCV animal model.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• I. 총 괄 현 황 ... 4
• 보고서 요약서 ... 5
• 요 약 문 ... 6
• SUMMARY ... 8
• 연구 성과 실적 및 향후 계획 ... 10
• 참여연구원 현황표 ... 14
• II. 총괄연구과제 연구결과 ... 15
• 1. 연구개발과제의 배경 및 필요성 ... 16
• 2. 국내외 기술개발 현황 ... 22
• 3. 연구개발과제의 추진체계 ... 24
• 4. 연구개발수행 내용 및 결과 ... 25
• 5. 목표달성도 및 관련분야 기여도 ... 52
• 6. 향후 연구성과 추진 계획(※해당되는 경우만 작성) ... 53
• 7. 연구개발결과의 파급효과 ... 54
• 8. 연구개발결과의 활용계획 ... 56
• 9. 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 57
• 10. 참고문헌 ... 58
• IV. 첨 부 서 류 ... 59
• 2. 실적 증빙자료 ... 66
• 3. 기타 첨부서류 ... 97