초록 ▼

○ 본 과제에서는 OECD 내분비계장애물질 검색시험법 프로그램 참여를 위하여 화학물질들의 내분비계장애작용 중 안드로겐 활성을 검색하기 위하여 구축된 in vitro 안드로겐 수용체 전사활성시험법을 ICCVAM 권장사항에 맞춰 재확립 및 검증 연구를 최종 목표하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
○ 구축한 22Rv1/MMTV-E4 세포는 안드로겐 수용체 뿐 아니라 glucocorticoid 수용체도 발현하고 있으며, R1881에 의하여 KLK2 유전자 및 luciferase 발현이 증가되었다. ICCVAM 권장사항에 따라 양성대조물

○ 본 과제에서는 OECD 내분비계장애물질 검색시험법 프로그램 참여를 위하여 화학물질들의 내분비계장애작용 중 안드로겐 활성을 검색하기 위하여 구축된 in vitro 안드로겐 수용체 전사활성시험법을 ICCVAM 권장사항에 맞춰 재확립 및 검증 연구를 최종 목표하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
○ 구축한 22Rv1/MMTV-E4 세포는 안드로겐 수용체 뿐 아니라 glucocorticoid 수용체도 발현하고 있으며, R1881에 의하여 KLK2 유전자 및 luciferase 발현이 증가되었다. ICCVAM 권장사항에 따라 양성대조물질로 R1881로 사용하여 agonist 시험에서는 10^-8M, antagonist 시험에서는 3x10^-10M을 사용하였다. 실험 프로토콜은 3x10⁴cells/well로 96 well에 seeding하였으며, 총시험기간을 4일로 줄였으며, 실험결과 양성물질로 판단하는 기준은 agonist의 경우 사용한 화합물의 7단계 농도에서 어느 정도 의존성을 나타내며, 한 농도라도 10% 이상의 luciferase 활성이 증가된 물질, antagonist의 경우 사용한 화합물이 300pM R1881에 의한 luciferase 활성도를 30% 이상 감소시킨 것을 확인하였다.
○ 새로 구축한 실험 프로토콜로 작년에 실험했던 20종의 물질에 대하여 다시 실험을 실시하였을 때 agonist는 100%, antagonist는 85%의 정확도를 나타내었다. 32종의 물질에 대한 실험 결과를 분석했을 때 ICCVAM에서 24종의 화합물에 대한 판정기준이 제시되어 있어 24종에 대한 분석을 실시했을 때 정확도가 agonist와 antagonist 각각 83%와 71%가 나타났다. 이는 ICCVAM에서 제시한 판단기준이 정확치 않은 것도 한 이유라고 생각되어 판단에 대한 실험이 더 필요하였다.
○ 주관기관인 고려대를 비롯하여 한국생명공학연구원과 식품의약품안전연구원 등 3개 기관이 10종의 물질에 대하여 agonist 및 antagoist 실험을 실시하여 실험판정 및 기관별 inter-, intra-CV를 구하여 실험 프로토콜에 대한 검증을 하였다. 그 결과 agonist, antagonist에 대한 정확성은 3기관 모두 80%이상을 나타내었으며, 3개 기관에서 모두 공통적으로 false positive로 나타난 것은 17α-Ethynylestradiol로 이에 대한 연구가 필요하였다. 각 기관의 intra CV 값은 agonist의 경우는 대부분 허용치인 10이하로 나타났으나 항안드로겐의 경우는 intra CV 값이 상대적으로 매우 크게 나타났으며 기관간에 대한 inter CV값은 허용한계치인 20-25%가 넘었다.

Abstract ▼

○ To participate the OECD program for the Endocrine Disrupter Testing and Assessment, we previously established in vitro androgen receptor transcriptional activation assay using 22Rv1/MMTV-E4 cells. In this year, we re-establish the assay protocol by the ICCVAM Review of In Vitro Endocrine Disruptor

○ To participate the OECD program for the Endocrine Disrupter Testing and Assessment, we previously established in vitro androgen receptor transcriptional activation assay using 22Rv1/MMTV-E4 cells. In this year, we re-establish the assay protocol by the ICCVAM Review of In Vitro Endocrine Disruptor Screening Assays, validated the assay protocol using the tentative endocrine disruptors.
○ 22Rv1/MMTV-E4 cells were expressed the receptors for the androgen and the glucocorticoid, and induced the expressions of KLK2 and luciferase by R1881. Reference androgen was used 10^-8M and 3x10^-10M methyltrienolone(R1881, CASRN 965-93-5) for agonism and antagonism assay, respectively. In re-established assay protocol, 3x10⁴cells/well were seeded in the 96 well white plate and total experimental course was reduced to 4 days from 5 days. The positive/negative result outcomes based on the PC10, PC50 and EC50 for agonist and IC30,IC50 and EC5 for antagonist.
○ The assay performance parameters for the proposed AR-STTA assay about 20 chemicals which were carried out the experiment at last year, accuracy, sensitivity and specificity were 100%, 100% and 100% for agonism assay and 85.0%, 100% and 83.3% for antagonism assay, respectively. Among this year 32 substances, 24 chemicals were reviewed the criteria as a agonist or antagonist in ICCVAM, were compared with those of ICCVAM. The accuracy, sensitivity and specificity were 83%, 100% and 75% for agonism assay and 71.0%, 100% and 65.0% for antagonism assay, respectively. These results might partly due to the unclear criteria proposed by ICCAM review.
○ For inter- and intr-laboratory validation study, three institutions, Korea university (KU), National institute of Food and Drug safety evaluation (NiFDS) and Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) were conducted experiments using 10 chemicals for androgenic and anti-androgenic activities. Although the accuracys of androgenic and antiandrogenic activities in the results of three institutes were over 80%, inter CV values of inter-laboratory was over 20 to 25% which is the maximal permissible limit for the inter-laboratory validation. 17α-Ethynylestradiol appeared as false positives for agonism and antagonism assay from all three agencies.

목차 Contents

• 용역연구개발과제 최종보고서 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목 차 ... 3
• I. 총괄연구개발과제 요약문 ... 5
• 국문 요약문 ... 5
• Summary ... 7
• II. 총괄연구개발과제 연구결과 ... 9
• 제1장 총괄연구개발과제의 목적 및 필요성 ... 9
• 제2장 총괄연구개발과제의 내용 및 방법 ... 21
• 제3장 총괄연구개발과제의 최종결과 및 고찰 ... 31
• 제4장 총괄연구개발과제의 연구성과 ... 103
• 제5장 총괄주요연구 변경사항 ... 105
• 제6장 총괄참고문헌 ... 106
• 제7장 총괄첨부서류 ... 109