초록 ▼

III. 연구의 내용 및 결과
1. 구조기반 결빙방지물질 발굴
가. 극지 버섯 19종, 극지 곤충 4종, 남극 빙하 미생물에서 발현되는 결빙방지단백질을 찾고자 하는 실험을 진행하여, 극지버섯 2종, 극지 곤충 2종, 빙하미생물 3종에서 결빙방지활성을 나타내는 물질이 존재함을 확인하였다. 결빙방지물질의 유전자를 찾기 위해 빙하미생물 2종의 전체 게놈 분석을 수행하였다.
나. 여러 가지 Type별 재조합 결빙방지단백질의 확보를 위해 총 15종의 결빙방지단백질을 Pichia pastoris 효모 발현 시스템을 이용해서 발

III. 연구의 내용 및 결과
1. 구조기반 결빙방지물질 발굴
가. 극지 버섯 19종, 극지 곤충 4종, 남극 빙하 미생물에서 발현되는 결빙방지단백질을 찾고자 하는 실험을 진행하여, 극지버섯 2종, 극지 곤충 2종, 빙하미생물 3종에서 결빙방지활성을 나타내는 물질이 존재함을 확인하였다. 결빙방지물질의 유전자를 찾기 위해 빙하미생물 2종의 전체 게놈 분석을 수행하였다.
나. 여러 가지 Type별 재조합 결빙방지단백질의 확보를 위해 총 15종의 결빙방지단백질을 Pichia pastoris 효모 발현 시스템을 이용해서 발현을 시도하였고 활성 및 발현을 나노리터 오스모미터, SDS-PAGE로 확인하였다.
다. 북극 효모 (Leucosporidium sp. AY30) 유래 결빙방지단백질 (LeIBP)의 유전자를 찾고, 재조합 LeIBP 단백질을 대장균과 Pichia pastoris에서 각각 발현하여 대량 생산 시스템을 구축하였다.
라. LeIBP 결빙방지단백질의 삼차구조를 규명하고 구조정보로부터 얼음결합부위 및 결빙 방지기작을 규명하였다.
마. 남극 호냉성 박테리아 (Flavobacterium frigoris PS1) 유래 결빙방지단백질 (FfIBP)의 유전자를 찾고, 재조합 FfIBP를 대장균 발현시스템을 이용해서 생산에 성공하였다.
바. 생산된 재조합 FfIBP 의 고해상도 삼차구조를 규명하고 얼음결합부위 및 결빙방지활성을 측정하였다.
사. Sea ice diatom (Navicula glaciei) 유래 결빙방지단백질 (NglIBP)을 재조합으로 대장균에서 발현하여 대량생산 시스템 구축하였다.
아. 극지 어류 (Ocean pout) 유래 재조합 Type III AFP를 대장균 발현 시스템을 이용하여 발현 및 정제에 성공하였다.
2. 줄기세포 냉동보존법 개발
가. 결빙방지단백질을 포함한 지방조직 유래 중간엽줄기세포의 동결보존 효율을 세포 증식능, 줄기세포 고유 표지자 발현도 및 분화능을 시험하여 평가한 결과 기존 화학 동결보존제와 동물유래 혈청의 농도를 획기적으로 낮추고도 더 나은 동결보존 효율을 가지는 것을 확인하였다.
나. 제대혈 유래 중간엽줄기세포의 6개월 장기 냉동보존시 결빙방지단백질의 효율성이 기존 조성 대비 10% 이상 향상되었고 줄기세포 고유 표지자 발현도 및 분화능에도 이상 없음이 확인되었다.
3. 생체조직 동결보존법 개발
가. 생식세포의 생존율을 향상시킬 수 있는 동결 전 처치액의 최적화를 완성함
나. 말의 양막을 -80℃ 저장한 후 이식거부반응을 줄인 후에 각막질환이 있는 개에 이식한 결과 각막 치료에 있어 좋은 결과를 얻음
다. 동결보존에 쓰이는 희석액과 동결액의 종류의 다양성으로 인해 돼지정자에 가장 적합한 희석액을 모색한 후, 이를 최적화 된 동결조건과 동결과정을 모색하여 방법에 있어서도 보존율 향상을 극대화 함
라. 동결 보존한 생체조직(각막)을 이용한 수술기법을 적용하였음
마. AFP를 첨가한 동결정자의 인공수정 한 후 초기 임신을 확인 하였음
바. 조직에서는 AFP 1 mg 이상 사용하였을 때 동결 방지의 효과를 확인 하였음
4. 동결보존제 후보물질 발굴
가. 당 펩타이드 및 유도체 합성을 위해 펩타이드 및 펩토이드 모노머 합성법을 확립하고 결빙 펩타이드 및 펩토이드 단량체를 합성하여 결빙방지 활성을 확인한 결과 얼음 재결정화에 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
나. 펩토이드 모노머를 이용하여 결빙방지 당펩타이드의 활성을 나타내기 위해 꼭 필요한 잔기의 위치 연구를 수행하여 향후 보다 안정하고 활성이 좋은 결빙방지 펩타이드 개발에 필요한 아미노산 유도체 발굴의 기반을 구축하였다.
5. 결빙방지물질 대량생산 시스템 개발
가. 재조합 LeIBP의 발현조건 즉, 배양온도, 배양시간, pH, 배양방법, 코돈 최적화 작업을 수행하여 대량 생산의 효율을 극대화 시키는 작업을 수행하였다.
나. Pichia 생산균주로부터 재조합 LeIBP를 대량발현 하여 ammonium sulfate 침전법, ion-exchange chromatography, size-exclusion chromatography를 이용한 대량 정제 프로토콜을 구축하였다.
다. 대장균에서 생산된 FfIBP, NglIBP, Type III AFP의 경우에는 단백질의 앞쪽에 His-tag을 붙여서 His-tag affinity column을 이용한 one-step purification을 가능하게 하였다.
라. LeIBP를 핵심으로 하는 동결보존제의 시제품 6종의 조성을 확립하였다.

Abstract ▼

III. Contents and Results
1. Obtaining and structural charactrization of antifreeze materials
1.1 Experiments to find hyper-active antifreeze materials from polar mushroom species, polar insect species, glacial microbial species were performed.
1.2 A total of 15 kinds of antifreeze proteins

III. Contents and Results
1. Obtaining and structural charactrization of antifreeze materials
1.1 Experiments to find hyper-active antifreeze materials from polar mushroom species, polar insect species, glacial microbial species were performed.
1.2 A total of 15 kinds of antifreeze proteins were tested using Pichia pastoris yeast expression system.
1.3 Expression systems for LeIBP protein from Arctic yeast (Leucosporidium sp. AY30) were built for the mass production.
1.4 Ice binding site and antifreeze mechanism of LeIBP was revealed based on its structural information.
1.5 Recombinant FfIBP proteins were successfully produced in E. coli expression system.
1.6 High-resolution three-dimensional structure of FfIBP revealed the ice-binding site and its antifreeze mechanism.
1.7. Mass-production system of Sea ice diatom (Navicula glaciei) antifreeze protein was built.
1.8. Recombinant Type III AFP was successfully expressed and purified.
2. Development of stem cell cryopreservation protocol
2.1 Confirmation of a better cryopreservation efficiency of AFP based cryopreservation soution for mesenchymal stem cells originated from adipose tissue.
2.2 Confirmation of a better cryopreservation efficiency of AFP based cryopreservation soution for mesenchymal stem cells originated from cord blood cell.
3. Development of biological tissue cryopreservation methods
3.1 Obtaining a optimized protocols for making pretreatment solution of germ cell cryopreservation
3.2 Obtaining good results reducing rejection response of cornea transplant after cryopreservation in -80 °C.
3.3 Survival rate improvement of cryopreserved pig sperm by exploring ways in the most suitable diluent, freezing process, freezing conditions and retention time.
3.4 Application of surgical technique using cryopreserved cornea
3.5 Confirmation of early pregnancy after artificial insemination of frozen sperm using AFP based cryopreservation solution
3.6 Confirmation of efficacy of AFP for tissue cryopreservation
4. Development of new-type antifreeze materials
4.1 Confirmation of recrystallization inhibition activity of synthesized AFGP and AFGP derivatives
4.2 Discovery of peptoid-bond based AFGP derivatives possessing antifreeze activity.
5. Development of mass-production system of antifreeze materials
5.1. Expression conditions (incubation temperature, induction time, pH, culture methods, codon optimization etc.) of recombinant LeIBP were optimized to maximize the efficiency of mass production.
5.2. Mass purification protocol of recombinant LeIBP was established using ammonium sulfate precipitation, ion-exchange chromatography and size-exclusion chromatography.
5.3. Recombinant FfIBP, NglIBP and Type III AFP proteins were produced in E. coli with His-tag affinity tag for a one-step purification using His-tag affinity column.
IV. Future direction and applications
1. We have succeeded to produce recombinant antifreeze proteins massively. Our next plan is to develop efficient cryopreservation solutions for valuable bioresources using the obtained recombinant antifreeze proteins (LeIBP, FfIBP, NglIBP, Type III AFP).
2. Recombinant antifreeze proteins can be used for cosmetics, ice cream texture improvement additives, frozen food field and the development of transgenic animals and plants in addition to the cryopreservation of biological resources.
3. Structural information of LeIBP and FfIBP is expected to be utilized in the design of improved antifreeze proteins.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 보고서요약서 ... 3
• 연구요약 ... 5
• SUMMARY ... 9
• CONTENTS ... 12
• 목차 ... 23
• 제 1 장 연구과제의 개요 ... 32
• 제 1 절 연구목적 및 연구범위 ... 32
• 1. 최종 연구목표 ... 32
• 2. 연차별 연구목표 및 연구내용 ... 33
• 3. 연구의 필요성 ... 34
• 가. 국가·사회적 측면 ... 34
• 나. 경제·산업적 측면 ... 35
• 다. 사회·문화적 측면 ... 35
• 라. 기술적 측면 ... 35
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 37
• 제 1 절 기술동향 분석 ... 37
• 1. 결빙방지물질, 결빙방지물질 대량생산 시스템 연구 환경변화 ... 37
• 가. 결빙방지단백질, 동결보존제 분야 논문 동향 분석 ... 37
• 나. 동결보존 분야 논문 동향 분석 ... 39
• 다. 동결보존관련 특허 동향 분석 ... 41
• 라. 기술 분야별 주요 특허 분석 ... 43
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 47
• 제 1 절 연구개발 수행 내용 및 연구결과 ... 47
• 1. 구조기반 결빙방지물질 발굴 ... 47
• 1.1 극지 생물 유래 고활성 결빙방지물질 탐색 및 개발 ... 47
• 가. 신규 고활성 결빙방지물질 및 해당 유전자 확보 (2종이상) ... 47
• (1) 남극 bacteria Flavobacterium frigoris 유래 결빙방지단백질 유전자 발견 및 확보 ... 47
• (2) 북극 분리·동정 균주 활성 측정 ... 52
• 나. 결빙방지능을 보유한 극지미세조류 선발 ... 53
• (1) 총 59종의 남극 및 북극 미세조류의 얼음결함 ... 53
• (2) 남극 해양미세조류 P.gelidicola유래 결빙방지물질 유전자 확보 ... 54
• (3) P.gelidicola 유래 결빙방지물질 유전자 기반 재조합 단백질 합성 ... 55
• 1.2 결빙방지단백질의 구조적 특성 및 얼음결합 부위 분석 ... 56
• 가. 재조합 LeIBP 결빙방지단백질의 2차 구조 분석 ... 56
• 나. LeIBP 결빙방지단백질의 당 구조 분석 ... 56
• (1) Native LeIBP, pLeIBP, bLeIBP 분자량 측정 ... 57
• (2) pLeIBP의 N-glycosylation 확인 ... 57
• 다. 결빙방지단백질(LeIBP)의 삼차구조 분석 ... 58
• (1) bLelBP 결정화 및 X-선 회절 데이터 수집 ... 58
• (2) bLelBP의 삼차 구조 ... 59
• (3) pLelBP 결정화 및 X-선 회절 데이터 수집 ... 60
• (4) pLelBP의 삼차 구조 ... 61
• 라. GFP_AY30AFP의 Ice etching 실험 ... 61
• 마. LeIBP 의 얼음결합부위를 규명 ... 62
• (1) 얼음결합 부위 규명을 위한 mutant 제작 ... 62
• (2) 결합부위 확인을 위한 다양한 mutant의 TH 활성 비교측정 ... 63
• (3) LeIBP와 얼음결정과의 상호작용 모델 ... 63
• (4) FfIBP의 삼차구조 및 다른 결빙방지단백질과의 비교 ... 64
• 1.3 결빙방지물질 발현시스템 구축 및 개선 ... 68
• 가. 재조합 결빙방지단백질 생산균주 2종 이상 발굴 ... 68
• (1) Type III AFP의 유전자 확보 및 발현 테스트 ... 68
• (2) NglIBP의 유전자 확보 ... 70
• 나. 기존 AFP와 비교 데이터 확보 ... 71
• 다. 결빙방지물질의 생물학적 생산 시스템 개선 ... 71
• (1) 2종 이상의 신규 결빙방지물질의 발현시스템 구축 ... 71
• (2) 2종 이상의 난생산성 또는 저생산성 결빙방지물질의 생산성 개선 ... 72
• (3) 피키아 발현시스템을 이용한 재조합 FfIBP 및 기능개선형 LeIBP 발현 시스템 구축 ... 73
• 1.4 기능개선형 결빙방지물질 개발 ... 74
• 가. 기능 개선형 결빙방지단백질 1종 확보 ... 74
• (1) LeIBP 결빙방지단백질 구조정보를 이용하여 단백질의 안정성과 활성이 증가된 기능 개선형 결빙방지단백질 제작 ... 74
• (2) 기능 개선형 결빙방지단백질 발현 테스트 ... 74
• 나. TH 활성을 증가시키는 enhancer 물질 탐색 ... 75
• (1) nLeIBP의 TH 활성을 증가시키는 enhancer 물질 탐색 ... 75
• (2) pLeIBP의 TH 활성을 증가시키는 enhancer 물질 탐색 ... 75
• 1.5 결빙방지물질의 안전성 평가 ... 76
• 가. 설치류 및 비설치류 동물독성 시험, 안점막 자극시험, 피부점막자극시험 수행 ... 76
• 나. cytotoxicity assay of pLeIBP in HaCaT (keratinocyte) ... 77
• 다. 해동 후 결빙방지단백질에 의한 피부세포 증식 효과 ... 78
• 2. 줄기세포 냉동 보존법 개발 ... 79
• 2.1 결빙방지물질의 중간엽줄기세포 영향평가 ... 79
• 가. 결빙방지물질 선별 및 단기 영향 평가 ... 79
• (1) 결빙방지단백질의 생산 및 확보 ... 79
• (2) 중간엽줄기세포의 영향 평가 및 동결액 조성 시험 ... 80
• (3) 결빙방지단백질 냉동보존액 해동 후 줄기세포 특성 분석 ... 84
• 나. 해동 후 장기 영향 평가 ... 90
• (1) 결빙방지단백질 냉동보존액 보관 후 중간엽줄기세포 배양능 비교 ... 90
• (2) 줄기세포의 해동 후 분화능 시험 ... 91
• 2.2 줄기세포 고유능 분석을 통한 안정적 냉동보존액 개발 ... 96
• 가. 결빙방지물질 조합한 기존 냉동보존제 및 프로토콜 개량 ... 96
• (1) 개발 중인 결빙방지단백질 냉동보존액과 시판 세포보관액의 비교 결과 ... 96
• 나. 결빙방지물질의 보존제 효율성 평가 ... 101
• (1) 기존 최적 조합 확인 및 FBS 감소 최적 조합 산출 ... 101
• (2) FBS 감소 최적 조합 산출 ... 102
• (3) 기존 배양액 내 고농도(0.1%) AFP 첨가 후 세포 형태 및 증식 테스트 ... 103
• 다. 해동 후 장기 영향 평가 ... 104
• (1) 극지결빙방지물질 새 조합의 장기 냉동 영향 평가 ... 104
• 2.3 조혈줄기세포의 결빙방지물질의 냉동 영향 평가 ... 110
• 가. 조혈줄기세포의 회수율과 생존율 조사 ... 110
• 나. 조혈줄기세포의 조혈세포 분화 유도 결과 ... 111
• 다. 제대혈 냉동 보존제 개발 ... 112
• (1) 결빙방지물질을 이용한 냉동 보존제 최적화 ... 112
• (2) 간엽줄기세포의 대표적인 표지 마커의 변화 유무 평가 ... 115
• (3) 극지결빙방지물질의 냉동 영향 평가 ? 분화 ... 115
• (4) 제대혈 냉동 시 극지결빙방지물질 첨가 효과 테스트 ... 116
• (5) 제대혈 단핵세포 (MNC) 냉동 효과 재확인 실험 ... 117
• (6) 다른 종류의 AFP 동결 보존 효과 테스트 ... 118
• 3. 생체조직 동결보존법 개발 ... 120
• 3.1 생식세포 동결보존 연구 ... 120
• 가. 최적화 실험수행 ... 120
• (1) 극지유래 결빙방지물질을 활용한 생식세포 동결보존후 임상적용 및 동결보존된 심장 판막을 이용한 동물실험 ... 120
• 나. 분자적 수준의 활성 ... 122
• (1) 동결 전후의 생식세포 (돼지 정자)의 양적 질적 평가 ... 122
• 다. 임상적용 ... 127
• (1) 동결보존 시제품 개발을 위한 동물실험 실시 ... 127
• 3.2 결빙방지물질을 활용한 생체조직 보존기술 개발 ... 132
• 가. 생유성 평가 ... 133
• (1) 동결 보존한 생체조직의 이식을 통한 생동성 평가 ... 133
• (2) 문헌 정리 및 자료 수집 ... 134
• (3) 이첨판의 동결보존을 통한 조직학적 분석 비교 실험 ... 134
• 나. 결빙방지물질의 영향평가 ... 137
• (1) 천연 결빙방지 단백질을 이용한 조직판막 동결 ... 137
• 3.3 면역 세포의 동결보존법 개발 ... 142
• 가 면역세포 동결시 첨가물질에 대한 기준 설정 ... 142
• (1) 새로운 동결 보존제에 대한 적절한 용량 및 용기 설정 ... 142
• (2) 연구개발 수행 결과 ... 145
• 나. 결빙방지물질을 이용한 면역세포의 동결보존법 개발 ... 149
• (1) 새로운 동결 보존제를 사용하여 동결 및 해동 하였을 때 정상세포와의 비교 분석 ... 150
• 3.4 결빙방지물질을 이용한 적혈구 냉동 보존 효능 검증 ... 157
• 가. 인간 적혈구를 이용한 마이크로 규모의 냉동보존 효능 검증 ... 157
• (1) 인간 적혈구의 용혈도 분석 (소규모: 100 ul) ... 157
• (2) 인간 적혈구의 동결-해동 후의 적혈구 회수도와 세포크기 측정 (소규모: 100 ul) ... 158
• 나. 비글견 적혈구를 이용한 실험실 규모의 대량 냉동보존 효능 검증 ... 159
• (1) 대량 동결보존된 비글견 적혈구의 용혈도 측정 (동결보존 규모: 10 ml) ... 159
• (2) 대량 동결보존된 비글견 적혈구의 세척후 적혈구 회수율과 세포크기 측정 ... 160
• (3) 대량 동결보존된 비글견 적혈구의 2,3-DPG assay ... 162
• 3.5 동물세포 및 기타 세포 동결보존법 개발 ... 162
• 가. 암세포, 신경세포, 골세포, 피부세포의 동결보존 ... 162
• (1) 동결 보존 된 세포를 해동 후 함께 처리한 결빙방지단백질에 의해 세포 생존능력이 향상하는지 확인 ... 163
• 나. 암줄기 세포의 동결보존 ... 163
• (1) 판매중인 동결보존제와 결빙방지단백질 함께 처리시 세포 생존능력 비교 ... 163
• 다. 규조류의 동결 보존 ... 165
• (1) Diatom 동결보존 프로토콜 확립 및 효과 검증 ... 165
• 라. 새 동결 방법 (Vitrification)에서의 극지결빙방지물질 효과 ... 166
• (1) Vitrification 방법 및 극지결빙방지물질 효과 ... 166
• 4. 동결보존제 후보물질 발굴 ... 167
• 4.1 당펩토이드 단량체 합성법 개발 ... 168
• 가. Glycopeptoid 의 합성법을 확립 ... 168
• 나. 당펩토이드 단량체를 이용한 펩토이드 유도체 합성 ... 169
• (1) Glcycopeptoid 와 자연에 존재하는 당 펩타이드의 활성차이를 알아보기 위해 표준품 합성 ... 169
• 다. 합성된 유도체를 이용 활성 측정 ... 169
• (1) 합성된 표준품 활성 측정 ... 169
• (2) Positional Scanning 및 활성 측정 ... 170
• 라. 당펩토이드 단량체를 이용한 cyclic glycopeptoid 유도체 합성 ... 172
• 5. 결빙방지 단백질의 대량 생산 시스템 개발 ... 174
• 5.1 결빙방지단백질 재조합 발현 피키아 균주 개발 ... 174
• 가. 결빙방지유전자 최적화 발현벡터 개발 ... 174
• 나. 다양한 type의 재조합 결빙방지단백질 생산을 위한 발현벡터 구축 ... 175
• 다. 발현 균주 조건 탐색 ... 175
• (1) 발현조건 의 최적화를 통한 발현양 증가 (0.7g/L -> 1g/L) ... 175
• (2) 배양조건 (생산유도체, 생산배지등) 의 최적화를 통한 대량생산 단가 절감 (100만원/g -> 20만원/g) ... 176
• 5.2 대량생산 시스템 개발 ... 177
• 가. 랩 스케일 생산 ... 177
• 나. 파일럿 스케일 생산 ... 177
• (1) 생산과정 ... 177
• (2) 재조합 결빙방지단백질 대량생산 수행 결과 ... 177
• (3) 결빙방지 활성을 보유한 재조합 단백질의 대량생산 ... 178
• 5.3 대량 정제 시스템 확립 ... 179
• 가. 크로마토그래피 ... 179
• (1)크로마토그래피 컬럼을 이용한 재조합 pLeIBP 정제 ... 179
• 나. 에탄올 침전법을 이용한 재조합 pLeIBP 대량 정제 프로토콜 확립 ... 180
• 다. 암모니움 설페이트 법 ... 180
• 라. 생산단가 절감을 위한 정제 프로토콜 세분화 ... 181
• 5.4 기능개선형 단백질을 포함한 대량 생산 시스템 2종 추가 확립 ... 181
• 가. FfIBP 대량생산 ... 182
• 5.5 기존제품 분석 및 시제품 개발 ... 183
• 가. 기존제품 분석 ... 183
• 나. 시제품 조성 ... 183
• 5.6 기술 수준 및 가치 평가 ... 185
• 가. 재조합 LeIBP 결빙방지단백질 대량생산에 대한 기술수준 및 기술가치평가 수행 ... 185
• 5.7 시장분석 및 기술 이전 계획수립 ... 187
• 가. 시장분석 및 기술이전 계획수립 ... 187
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 190
• 제 5 장 연구결과의 활용계획 ... 192
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 193
• 제 7 장 참고문헌 ... 194
• <별첨1> 1차년도 (2010년) 발표논문 ... 196
• <별첨2> 2차년도 (2011년) 발표논문 ... 199
• <별첨3> 3차년도 (2012년) 발표논문 ... 205
• <별첨4> LeIBP 결빙방지단백질 관련 기술가치평가 결과 요약서 ... 216
• <별첨5> 재조합 LeIBP 결빙방지단백질의 CTFA (세계화장품원료협회) 화장품 원료물질 승인 ... 219
• <별첨6> 재조합 LeIBP 결빙방지단백질의 물질안정성평가자료 ... 221
• 부록 ... 238
• 1. 연구성과 집계(최종 보고서 부록) ... 238
• 가. 논문게재 성과 ... 238
• 나. 특허성과 ... 240
• 다. 기술료 징수 현황 ... 241
• 라. 사업화 현황 ... 241
• 마. 인력 활용/양성 성과 ... 242
• 바. 국제화/협력 성과 ... 242
• 사. 경제 사회 파급 효과 ... 243
• 2. 정책적 활용 실적 및 성과 ... 243
• 3. 구매금액이 3천만원 이상인 기자재 구매현황(NTIS 등록 사항) ... 243