초록 ▼

- 국내외적으로 메타게놈에 대한 연구는 필요성이 높아져 가고있음에 반하여 단백질의 낮은 스크리닝 효율에 제약을 받고 있음.
- 이러한 문제점을 극복하기 위한 수단으로써 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 단백질의 초고속 발현 및 스크리닝 기술을 확보하고자 함.
- 가장 먼저, 목적 유전자의 아미노산 scanning을 위하여 무작위 위치 치환 혹은 삽입기술을 개발하였고 목적 효소의 활성에 영향을 미치는 아미노산 잔기를 탐색하기 위한 기술을 개발함.
- 유용효소의 활성에 영향을 주는 아미노산 잔기를 무작위로 변화를 가

- 국내외적으로 메타게놈에 대한 연구는 필요성이 높아져 가고있음에 반하여 단백질의 낮은 스크리닝 효율에 제약을 받고 있음.
- 이러한 문제점을 극복하기 위한 수단으로써 무세포 단백질 합성 시스템을 이용하여 단백질의 초고속 발현 및 스크리닝 기술을 확보하고자 함.
- 가장 먼저, 목적 유전자의 아미노산 scanning을 위하여 무작위 위치 치환 혹은 삽입기술을 개발하였고 목적 효소의 활성에 영향을 미치는 아미노산 잔기를 탐색하기 위한 기술을 개발함.
- 유용효소의 활성에 영향을 주는 아미노산 잔기를 무작위로 변화를 가하여 라이브러리를 제작하고, PCR을 기반으로 제작된 선형 유전자를 무세포 단백질 합성 시스템에 직접적으로 도입하여 목적 효소를 발현하는 기술을 확보함.
- 위의 개발된 기술들을 자동화된 HTS시스템에 적용하여 약 1만여개 혹은 그 이상의 라이브러리로부터 활성이 증대된 유용효소의 탐색(발현 및 스크리닝)이 용이한 플랫폼을 확보함.
- 위의 플랫폼은 다양한 유용 효소의 탐색을 선도할 수 있는 기반 기술로써의 가치를 가지며, 다양한 산업으로의 활용가치를 지닐 것으로 사료됨.

Abstract ▼

The methodology for the molecular evolution of protein molecules has so far relied upon the creation of random mutant genes and subsequent screening of the resulting variant proteins. In addition, rational design approach also has been implemented when enough information is available upon the struct

The methodology for the molecular evolution of protein molecules has so far relied upon the creation of random mutant genes and subsequent screening of the resulting variant proteins. In addition, rational design approach also has been implemented when enough information is available upon the structure of target proteins. However, random introduction of mutations accompanies substantial limitations due to the massive size of the libraries while substantial proportions of mutant genes in the library are not functional templates due to the introduction of stop codons as well as the frame shift during the mutational processes. On the other hand, the computational technology for the prediction and design of ' optimal' amino acid sequences is still far away from being reliable. In this study, we attempt to develop a method to create mutant libraries that consists of ' expressible' variant sequences. By reducing the size of the mutant libraries in this way, we expect to improve the efficiency of finding the mutant genes carrying desired traits. Through in-frame introduction of specific codons into nonspecific locations over the structural genes, we would be able to find the ' hot-spot' residues that affect the structure/function of enzymes.
Subsequently, through the combination of the developed method with the techniques of cell-free protein synthesis utilizing immobilized ribosomes, we aim to establish a technological platform for the discovery of novel enzymes that meet the specific requirements in various applications.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 2
• 보고서 요약서 ... 3
• 요 약 문 ... 4
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 8
• 목 차 ... 10
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 13
• 제 1 절 연구개발의 필요성 ... 13
• 1. 기술적 측면 ... 13
• 2. 경제, 사회적 측면 ... 13
• 3. 사회, 문화적 측면 ... 13
• 제 2 절 연구개발의 목적 및 기대효과 ... 14
• 1. 연구개발의 목적 ... 14
• 2. 기대효과 ... 14
• 제 3 절 연구개발 추진체계 및 방법 ... 15
• 1. 연구개발 추진체계 ... 15
• 2. 연구개발 추진체계의 도식도 ... 16
• 제 2 장 국내・외 기술개발 현황 ... 17
• 제 1 절 국내동향 ... 17
• 1. 산업계 동향 ... 17
• 2. 학계 동향 ... 17
• 3. 연구계 동향 ... 17
• 제 2 절 국외동향 ... 17
• 제 3 절 국내·외 수준과 기술격차 동향 ... 18
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 19
• 제 1 절 신규활성효소의 탐색을 위한 단백질 번역 플랫폼으로서의 무세포 단백질 생산 시스템 ... 19
• 1. 무세포 단백질 생산 시스템 ... 19
• 가. 무세포 단백질 생산 시스템의 기술개요 및 생산의 원리 ... 19
• 나. 무세포 단백질 생산 시스템의 역사 ... 23
• 다. 무세포 단백질 생산 기법의 장점과 과제 ... 23
• 2. 대장균 유래의 무세포 단백질 생산 시스템의 생산성 및 경제성 향상 ... 25
• 가. 생산성 향상을 위한 Dual energy source의 이용 ... 25
• 나. 경제성 향상을 위한 S12의 제조 ... 28
• 제 2 절 PCR template를 활용한 무세포 단백질 생산 시스템의 구축 ... 32
• 1. PCR template를 이용한 무세포 단백질 생산 시스템 ... 32
• 2. PCR 증폭된 유전자의 효율적인 발현 ... 32
• 3. PCR template를 이용한 무세포 단백질 생산 시스템의 응용분야 ... 35
• 제 3 절 산업용 효소 활성의 고속 스크리닝 연구 ... 37
• 1. Aminotransferase ... 37
• 2. Lipase ... 39
• 제 4 절 효소의 활성부위 탐색을 위한 아미노산 scanning 기술 ... 41
• 1. 단백질내 아미노산 scanning을 위한 기술의 개요 ... 41
• 2. 목적 유전자내 무작위 위치로 원하는 코돈(들)의 삽입 혹은 치환을 위한 유전자조작법 ... 41
• 3. 효소유전자 scanning을 위한 in-frame selection과 원하는 코돈 서열의 치환 혹은 삽입이 가능한 vector의 개발 ... 46
• 4. 무작위 치환 혹은 삽입이 가능한 목적 유전자 조작법 개발 ... 48
• 제 5 절 유전자 혹은 리보조옴의 고정화 기술 개발 ... 50
• 1. 유전자의 고정화와 이를 이용한 무세포 단백질 발현 ... 50
• 2. 유전자의 고정화와 고정된 유전자로부터 무세포 단백질 발현 시스템을 통하여 발현된 목정 단백질의 고정화 기술 개발 ... 52
• 제 6 절 변이된 효소 라이브러리의 초고속 발현 ... 56
• 1. 목적 효소의 활성부위 탐색 및 무작위 변이된 유전자 라이브러리의 확보 ... 56
• 2. HTS(high-throughput screening)시스템과 무세포 단백질 발현 시스템을 이용한 유전자 라이브러리의 발현 및 활성 측정 ... 56
• 제 4 장 연구개발 목표 달성도 ... 59
• 제 1 절 연구개발의 최종목표 ... 59
• 제 2 절 연차별 연구개발 목표 및 내용 ... 59
• 제 3 절 계획대비 달성도 ... 59
• 제 4 절 연구목표에서 중요도 순으로 5개 목표 추출 및 가중치 부여 ... 60
• 제 5 장 연구개발 결과의 활용계획 ... 62
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 63
• 제 7 장 참고문헌 ... 64