초록 ▼

○ 연구결과
① Herboxidiene의 생합성 유전자 확보, 유전자 분석 및 규명
● S. chromofuscus genome 분석 총 9,142,143 bp, 인접 유전자 포함 herboxidiene 생합성 유전자 180 kb 확보 및 유전자 분석, 분석결과로부터 Herboxidiene 생합성과정 추정.
● 염기서열 분석을 통하여 1종 (herA)의 조절유전자를 예측하였고, herA를 과발현시킨 균주의 생산성 및 전사체 분석을 통하여 herboxidiene의 생합성 과정 중에 negative 조절 유전자의 역할을

○ 연구결과
① Herboxidiene의 생합성 유전자 확보, 유전자 분석 및 규명
● S. chromofuscus genome 분석 총 9,142,143 bp, 인접 유전자 포함 herboxidiene 생합성 유전자 180 kb 확보 및 유전자 분석, 분석결과로부터 Herboxidiene 생합성과정 추정.
● 염기서열 분석을 통하여 1종 (herA)의 조절유전자를 예측하였고, herA를 과발현시킨 균주의 생산성 및 전사체 분석을 통하여 herboxidiene의 생합성 과정 중에 negative 조절 유전자의 역할을 함을 규명함.
② 고생산성 균주 개발
● 재조합된 pACC152, pASA152, pSAM152, pAfsR152 및 pSA152 S. chromofurus 균주에 전이하여 각각 S. chromofurus ACC152, S. chromofurus ASA152, S. chromofurus ASM152, S. chromofucus AFSR152 및 S. chromofurus SAI152 균주를 제작.
● 최적배지를 이용하여 S. chromofuscus SIBR내에서 1.32배까지(0.976 g/L) 증가
● S. chromofuscus AFS는 1.7배(1.258 g/L) 증가
● S. chromofuscus GIBR은 3.85배(2.849 g/L) 증가
③ 대량생산을 위한 배지 최적화, 발효 및 분리공정 개발
● 유도체 검출을 위한 시료의 전처리 과정과 HPLC 및 LC-MS 분석방법의 정립.
● 기존 배지는 54.89 mg/L herboxidiene이 생산에서 carbon/nitrogen 최적화에 따라 200.2-744.6 mg/L (3.7-13.7 배)이 생산 증가.
● Feeding에 의한 생산성 증가 최적화: Glycerol과 ProFlo 배양 후 feeding 하여 herboxidiene 1087 mg/L (19.8 배)생산.
④ 조합생합성에 의한 유도체 개발을 통한 신규 제초제의 개발
● in vitro에 의한 Glucosyl-herboxidiene 및 Galacosyl- herboxidiene의 합성.
● pSET152 galU 및 yjiC를 재조합한 pGYIBR을 전이하여 S. chromofuscus GYIBR 균주로 부터 herboxidiene glycoside로 생산.
● 외래 epoF의 발현을 통하여 신규유도체로 보이는 물질을 HPLC-ESI-MS를 통하여 검출, 생산이 매우 소량되어 명확한 구조 분석을 실시하지 못하였음.
● 메타게놈을 이용한 herboxidiene 유도체: 국내 고유 토착 미생물 메타게놈 유전자은행 스크리닝, Tributyrin 가수분해 Esterase/Lipase 등 33종 확보, 염기서열 분석, ORF 확인, 신규성 유전자 4종 확인, 대장균에서의 대량발현 및 발현조절 및 Cold-active 에스테라아제 ES2-1 발현, 효소안정성, 기질특이성 분석.
⑤ Herboxidiene 및 그 유도체들의 제형개발을 통한 실용화
● 천연 제초제 기초 농업활성 측정; 애기장대 in vitro 제초활성 검증 및 MIC 측정, 잡초 8종에 대한 제초활성 확인 및 벼와 밀에 대한 위해성 확인
● : 국내 주요 밭작물 5종 (배추, 파, 김장무, 고추, 마늘)에 대한 허복시디엔 위해성 확인 및 허복시디에 제초제 작물별 유효 활성 농도 측정.
● 허복시디엔을 이용한 미생물 제초제 제형 실용화: 전착제 혼입을 통한 허복시디엔 제초활성 증진 확인 및 기존의 Sulfonate 성분 포함 전착제 (동부카바와 동방전착제)가 효율적 허복시디엔 제형개발에 가장 적합함을 확인.

Abstract ▼

Herboxidiene is a secondary metabolite produced mainly by Streptomyces strain A7847. Structural features of herboxidiene includete trahydrapyran acetic acid moiety, the conjugated diene system, and an ester group.
○ Analysis of herboxidiene gene cluster
I tried to sequence of S. chromofuscus g

Herboxidiene is a secondary metabolite produced mainly by Streptomyces strain A7847. Structural features of herboxidiene includete trahydrapyran acetic acid moiety, the conjugated diene system, and an ester group.
○ Analysis of herboxidiene gene cluster
I tried to sequence of S. chromofuscus genome and get the information of 9,142,143 bp. The biosynthetic gene cluster (60 kb) was identified from these results. The biosynthetic pathway of herboxidiene was proposed from the analyzed gene cluster. Also the gene cluster of herboxidiene was cloned from the DNA library.
○ The overproduction of herboxidiene by media optimization
The production media was optimized with carbon and nitrogen sources In order to produce herboxidiene efficiently. The results shaw the enhnacement of 200.2-744.6mg/L (3.7-13.7times) when it compared with the existing madia.
○ The development of S. chromofucus by genetic engineering
S. chromofucus was engineered to make the high producer of herboxidiene. pACC152, pASA152, pSAM152, pAfsR152 and pSA152 were constructed and they are tranfered to S. chromofucus. And finally S. chromofurus ACC152, S. chromofurus ASA152, S. chromofurus ASM152, S. chromofucus AFSR152 and S. chromofurus SAI152 were made from the transfermants.
● S. chromofuscus SIBR was enhanced to the production of 0.976g/L (1.32times).
● S. chromofuscus AFS는 was enhanced to theproduction of 1.258g/L (1.32times)
● S. chromofuscus GIBR was enhanced to the production of 2.849g/L (3.85times)
○ Synthesis of new herboxidiene derivatives.
● Herboxidiene glucoside and galactoside were synthesized by YjiC with UDP-glucose and UDP-galactose.
● The producer strain of herboxidiene glucoside (S. chromofuscus GYIBR) was constructed by the transfermation of the expression vector including yjiC and galU. This strain was identified to produce herboxidiene glucoside by Mass analysis.
● The epoF was expressed in homologous and heterlogous system to synthesized the new herboxidiene analogue. The new herboxidiene analogue including epoxide group was identified by Mass but was not identified by NMR yet.
● The function of herA gene was identified to express in S. chromofurus. This gene is the negative regulatory gene
○ Herboxide type for industrialization
The natural compound showed effective herbicidal activity at relatively low effective concentration (≃1,000μ g/ml) against most important domestic biannual weeds in Korea including Sorghum bicolor, Echinochloa crusgalli, Digitaria sanguinalis, Solanum nigrum, Aeschynomene indica, Abutilon avicennae, Arabiosopsis thaliana and Xanthium strumarium.
Herboxidiene inhibited both seed germination and stem elongation for these weeds. Addition of agricultural detergents containing sulfonate compounds to herboxidiene lowered in vitro effective concentration more than 5-fold.
Herboxidiene had photocytotoxicity to rice, chinese cabbage, radish, and pepper. However, herboxidiene caused no damage to garlic and various chives, suggesting herboxidiene as an important agricultural herbicide applicable to several major field crops in Korea like garlic and chives.
To investigate the enzymes that canenhance herbicidal activity, we constructed and screened esterases / lipases from “Dokdo”deep sea sediment microbial metagenomic libraries by using substrate (1% Tributyrin) hydrolysis assay. Screening of more than 42,000 individual clones identified 4 novel esterases among 32 esterase candidates. Further ORF cloning and protein expression in E. coli demonstrated 2 novel cold-active esterases may be useful for the ester group modification of herboxidiene at low reaction temperature.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 6
• CONTENTS ... 8
• 목 차 ... 9
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 12
• 제 1 절. 연구개발의 최종목표 ... 12
• 제 2 절. 연구개발의 필요성 ... 12
• 1. 국내외 농약시장 현황 분석 및 전망 ... 12
• 2. 합성농약의 문제점 및 미생물농약 개발의 필요성 ... 13
• 3. 미생물유래 친환경 미생물제초제의 필요성 ... 13
• 4. 상용화연구의 필요성 ... 14
• 제 3 절. 친환경 미생물제초제 herboxidiene ... 14
• 1. Herboxidiene의 구조 ... 14
• 2. Herboxidiene의 선택적 제초활성 ... 14
• 3. Herboxidiene 관련 특허 분석 ... 15
• 제 4 절. 연구개발의 범위 ... 15
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 17
• 제 1 절. 국 외 ... 17
• 1. 세계 농약 시장과 전망 ... 17
• 2. Herboxidiene의 전합성 (total synthesis) 연구 ... 17
• 3. 미생물의 생산성 향상 연구 ... 17
• 제 2 절. 국 내 ... 18
• 1. 국내 농약 시장과 전망 ... 18
• 2. 국내의 미생물의 생산성 향상 연구 ... 18
• 제 3 장 연구개발 수행 내용 및 결과 ... 20
• 제 1 절 연구 내용 및 방법 ... 20
• 1. 친환경 미생물제초제 herboxidiene의 생합성 유전자집단 및 경로규명과 공정개발 ... 20
• 가. Herboxidiene 생합성 유전자집단 확보 ... 20
• 나. Herboxidiene 생합성 경로 규명 ... 21
• 다. 최적발효(생산) 조건 검토 ... 21
• 라. 발효조에의 발효조건의 최적화 ... 21
• 마. Herboxidiene 및 유도체의 분리공정 최적화 및 scale-up ... 21
• 바. 대사체 분석에 의한 herboxidiene의 생합성 경로의 속도결정단계 진단 및 증폭 ... 21
• 2. 유전공학에 의한 herboxidiene 생산성 증가 ... 22
• 가. 생합성 전구체의 이종숙주 내 농도증가를 통한 생산성 향상 ... 22
• 나. Malonyl-CoA 및 metylmalonyl-CoA 세포내 농도 증가 전략 ... 22
• 다. CoA 및 acetyl-CoA의 세포내 농도 증가 전략 ... 23
• 라. SAM의 세포내 농도 증가 전략 ... 24
• 마. 조절 및 내성유전자를 통한 생산성 향상 전략 ... 24
• 3. 친환경 미생물제초제 herboxidiene의 유도체생산을 통한 신규 미생물제초제의 개발 ... 25
• 가. 당화반응에 의한 Herboxidiene glycoside 유도체 합성 ... 25
• 나. 조합생합성법을 통한 유도체 합성 ... 25
• 4. 작물별 허복시디엔 제초 활성 검증 ... 26
• 가. 활성 검증에 사용된 국내 주요 작물 ... 26
• 나. 천연제초제 허복시디엔과 작물 기내(in vitro) 배양 ... 27
• 다. 천연제초제 허복시디엔 혼입 전착제 ... 28
• 라. 허복시디엔 작물 온실 처리 ... 28
• 5. 허복시디엔 유도체 제작을 위한 토착 메타게놈 유전자 확보 ... 28
• 가. 미생물 메타게놈 시료 ... 28
• 나. 미생물 메타게놈 분리 및 유전자은행 제작 ... 29
• 다. 메타게놈 유전자은행에서 에스테라아제(Esterase) 스크리닝 및 클로닝 ... 29
• 라. 신규 에스테라아제의 생화학적 및 동역학적 특성분석 ... 30
• 제 2 절 연구 결과 ... 32
• 1. Strpetomyces chromofurus A7847 균주의 지놈분석 ... 32
• 가. Draft Sequencing ... 32
• 나. Assemble ... 32
• 다. NewGAS System 구축 완료 ... 32
• 2. Herboxidiene의 생합성 유전자 집단 확보 ... 33
• 가. Herboxidiene의 생산균주 genomic libray 제작 ... 33
• 나. Herboxidiene 생합성 유전자 집단 클론하기 위한 탐침 확보 ... 33
• 다. Colony hybridization ... 33
• 라. 유전자 분석과 추정되는 생합성 과정 ... 34
• 3. Herboxidiene 추출과 분석방법의 정립 ... 36
• 가. HPLC 및 MS 분석을 위한 시료의 전처리 방법 확립 ... 36
• 나. HPLC 및 LC-MS 분석방법의 정립 ... 37
• 4. 친환경 미생물제초제 herboxidiene의 배지 조성에 의한 생산성 증가 ... 39
• 가. Strpetomyces chromofurus A7847 균주의 배양과 herboxidiene의 분리 ... 39
• 나. 배지 최적화에 의한 herboxidiene 생산성 증가 ... 41
• 5. 유전공학에 의한 생산성 증가 균주 개발 ... 47
• (가) 생산성 증가 균주 개발 ... 47
• (나) Herboxidiene의 생산량 분석 ... 50
• 6. Herboxidiene glycoside의 합성 및 생산 ... 52
• 가. in vitro 에서 herboxidiene glycoside의 합성 ... 52
• 나. S. chromofuscus 균주에서 herboxidiene glycosides의 생산 ... 55
• 7. 조합생합성에 의한 Herboxidiene 신규 유도체의 개발 ... 58
• 가. 외래 P450 유전자의 발현을 위한 plasmid 및 균주 제작 ... 58
• 나. 외래 P450 유전자의 발현에 따른 신규유도체의 개발 ... 60
• 8. Herboxidiene 조절유전자의 기능 규명 ... 66
• 가. herA 유전자의 과발현 ... 66
• 나. herA 유전자가 과발현된 균주의 전사체 분석 ... 68
• 10. 천연제초제 허복시디엔의 제초 유효 활성 측정 ... 70
• 가. 애기장대를 이용한 허복시디엔 최소 활성 농도(MIC) 측정 ... 70
• 나. 고온 습식 멸균 처리에 의한 천연제초제 허복시디엔의 활성 변화 검증 ... 71
• 다. 전착제 사용에 의한 천연제초제 허복시디엔의 활성 변화 검증 ... 72
• 라. 수도작물 벼에 대한 천연제초제 허복시디엔의 활성 검증 ... 72
• 마. 천연제초제 허복시디엔의 종자발아억제 활성 검증 ... 73
• 바. 국내 주요 유해 잡초에 대한 천연제초제 허복시디엔의 경엽처리 활성 검증 ... 74
• 사. 국내 주요 밭 작물에 대한 천연제초제 허복시디엔의 경엽처리 약해 검증 ... 76
• 11. 천연제초제 허복시디엔 유도체 제작을 위한 토착 원천 에스테라아제 확보 ... 80
• 가. 메타게놈 유전자은행 스크리닝 및 클로닝 ... 80
• 나. 에스테라아제 유전자 분석 및 대장균 이종발현 ... 80
• 다. 신규 에스테라아제 ES2-1의 생화학적 특성분석 ... 82
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 85
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 89
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 90
• 제 7 장 연구시설‧장비 현황 ... 91
• 제 8 장 참고문헌 ... 92
• 연구개발보고서 초록 ... 94
• 끝페이지 ... 98