초록 ▼

○ 연구결과
중점연구대상 시료로 선정된 Bacillusidriensis (CGH 18)의 대량 배양액으로부터 다양한 크로마토그래피 기술을 이용하여 6개의 2차 대사물질을 분리하고 분광자료 분석을 통하여 분리한 화학물질들의 구조는 2,5-dike topiperazine 유도체들로 결정되었다. 대량생산을 위해 dike topiperazine 유도체 5종을 합성하고 in vitro와 in vivo 실험에서 11종 유도체의 항산화효과와 암세포 증식억제효과를 확인하였으며 Cyclo (L-Pro-L-Tyr)이 가장 강력한 효과를 보였다.

○ 연구결과
중점연구대상 시료로 선정된 Bacillusidriensis (CGH 18)의 대량 배양액으로부터 다양한 크로마토그래피 기술을 이용하여 6개의 2차 대사물질을 분리하고 분광자료 분석을 통하여 분리한 화학물질들의 구조는 2,5-dike topiperazine 유도체들로 결정되었다. 대량생산을 위해 dike topiperazine 유도체 5종을 합성하고 in vitro와 in vivo 실험에서 11종 유도체의 항산화효과와 암세포 증식억제효과를 확인하였으며 Cyclo (L-Pro-L-Tyr)이 가장 강력한 효과를 보였다. 홍게 다리껍질로부터 주정으로 추출한 카로티노이드 색소 역시 invitro(TOAC, TBARS, NO 생성)와 invivo (LPS로 산화적 스트레스를 유발한 동물모델계)실험에서 항산화 및 항염증효과를 보였다.홍게 다리껍질에 시판효소를 단독 혹은 혼합처리하여 단백질 분해능을 비교하였을 때 총 아미노산 함량은 PA+P 247.411 mg/g> PA+F(206.442mg/g)>PA+A(133.385mg/g)>PA+PM(59.131mg/g)>PA(54.875mg/g)의 순으로 혼합효소처리가 단일효소처리에 비해 높은 것을 확인할 수 있었다. 혼합효소처리한 홍게껍질의 아미노산 조성은 사용 효소에 따라 다소 차이가 있었으나 phenylalanine, glycine, alanine, leucine의 함량이 높았으며 tyrosine, cystine은 검출되지 않았다. 홍게 다리 껍질의 젖산 추출물에는 세린(serine)이 68.44%로 매우 다량 함유되어 있고,그 다음으로 히드록시라이신이 10.46%로 함유되어 있어 이들 2가지 종류의 아미노산 함량이 전체 아미노산의 78.9%를 차지하는 것으로 나타났다.또한 홍게 다리껍질 젖산 추출물은 세린과 칼슘을 비롯한 무기질이 풍부하여 수분 보유력이 뛰어나고 유화력 및 유화안정성이 우수하여 보습기능을 필요로 하는 로션이나 유화력이 요구되는 마요네즈, 빵, 쿠키 등에 응용하여 각각 skintest와 관능적 특성을 조사한 결과 실용화 가능성이 확인되었다. 젖산 추출물은 단회독성시험
결과 안전한 것으로 확인되었다.

Abstract ▼

IV. Results
1. Strains of more than 300 microorganisms have been isolated from several kinds of fermented sea foods and screened for their antioxidant activity and then 5 target microorganisms (SGC-8, SGC-9, SGC-11, CGH-18, and 6S-20) have been selected. They were identified as Bacillus idriensis

IV. Results
1. Strains of more than 300 microorganisms have been isolated from several kinds of fermented sea foods and screened for their antioxidant activity and then 5 target microorganisms (SGC-8, SGC-9, SGC-11, CGH-18, and 6S-20) have been selected. They were identified as Bacillus idriensis, Brevundimonas vesicularis, Pseudomonas oryzihabitans, Bacillus idriensis, and Acinetobacter junii based 16S rRNA sequence analysis.
2. Based upon the results of more extensive bioactivity tests of selected 5 strains, Bacillus idriensis (CGH18) have been finally selected for chemical investigation and cultivated in large-scale. Six 2,5-piperazinediones have been isolated from mycelium of Bacillus idriensis (CGH18).
3. The antioxidant activity of the compounds from Bacillus idriensis (CGH18) was evaluated by six different activity tests, including measurement of peroxynitrite,
DPPH, HO, O₂-*, and intracellular NO and ROS (reactive oxygen species). Cyclo(L-Pro-L-Tyr) (1) showed the potent scavenging effect on DPPH, hydroxyl and superoxide radicals, and peroxynitrite. Both cyclo(L-Pro-L-Phe) (2) and cyclo(L-Pro-L-Val) (3) exhibited the significant scavenging effect on peroxynitrite. Cyclo(L-trans-4-hydroxy-Pro-L-Phe) (6) inhibited remarkably production of intracellular ROS in a cellular system. In addition, antiproliferative effect on MCF-7, AGS, and HT-29 human cancer cell was estimated for the isolated 2,5-piperazinediones. Only cyclo(L-trans-4-hydroxy-Pro-L-Phe) (6) showed the strong inhibition against proliferation of all human cancer cells. Their protective effects on were also investigated. The good protective effect was observed for only cyclo(L-trans-4-hydroxy-Pro-L-Phe) (6). It also greatly decreased NO production in LPS-stimulated Raw 264.7 cells.
4. Total synthesis of 2,5-piperazinedione derivatives has been attempted in order to study relationship between structure and activity. Five compounds have been obtained by the proposed syntheic scheme: 2-benzylidene-2,5-piperazinedione (7), 3,6-(dibenzylidene)-2,5- piperazinedione (8), 3,6-(Di-4-hydroxybenzylidene) -2,5-piperazinedione (9), cyclo(L-Pro-Gly) (10), and cyclo (L-Pro-8-Ac-Gly) (11). They were evaluated for the same biological activities as suggested above. Compounds 7 and 9 effectively scavenged DPPH and hydroxy radicals, and intracellular ROS while 8 did DPPH radical and intracellular ROS.
Cyclo(L-Pro-8-Ac-Gly) (11) not only showed the strong scavenging effect on superoxide radical and intracellular ROS but also revealed the excellent protective effect againt UVB-induced human keratinocyte (HaCaT) damage among compounds tested. On the other hand, Cyclo(L-Pro-Gly) (10) significantly protected human keratinocytes from ultraviolet-derived oxidative stress.
5. 4% lactic acid extraction after ethanol extraction was the most effective yield in ash and protein ( Crude ash 63.39%, moisture 7.61% ± 0.86, crude fat 5.67% ± 0.75, crude protein 16.17% ± 2.23). Ca (455.27 mg/kg)and P (437.16 mg/kg) were dominating minerals and followed by K and Mg (25.87 mg/kg). distribution of protein MW of lactic acid extract was 25, 20, 8 kDa. The amino acid composition of lactic acid extract was unique, where serine was 70.83 mg/g and hydroxylysine was 10.82 mg/g, comprising 78.9% of whole protein.
6. Red crab shell was digested by commercial proteases, such as Protamex(P), Neutrase(N), Flavourzyme(F), Alcalase(A), Protease M(PM) and Protease A(PA). Protein yield analyzed revealed that PA was the enzyme having the highest proteolytic activity. SDS PAGE showed that molecular weight of proteins produced by protease treatments was various and below 150 kDa. Combinational treatment of proteases (PA+P, PA+PM, PA+F, PA+A) was tried whether these increase protein hydrolysis from red crab shell powder compared to PA single treatment. Amino acid concentration by combinational treatments was higher than PA single treatment (PA+P 247.4 mg/g > PA+F (206.4 mg/g) > PA+A (133.4 mg/g) > PA+PM (59.1 mg/g) > PA (54.9 mg/g)). Amino acid composition by combinational treatments was slightly different. Most abundant essential amino acids were phenylalanine, glycine, alanine, and leucine, whereas tyrosine and cystine were not detected.
7. Carotenoids was extracted with 95% EtOH (1:25) by boiling for 1.5hr at 100⁰C then evaporated in a rotary vacuum evaporator at 45℃ and then further lyophilized until dry. Yield of carotenoids was 2.54%. Carotenoid content of red crab shell was 157mg/100g. Carotenoids showed antioxidative and anti-inflammatory effect in vitro and in vivo.
8. Lactic acid extract turned out to be safe through single toxicity test. Lactic acid extract showed strong water holding capacity and emulsifying stability, which was applied to develop several products such as cosmetics, nutrition supplemented foods were made and applied to human skin test and sensory test, respectively. As a result, Incorporation of lactic acid extract in bakeries and mayonnaise increased water holding capacity and emulsifying stability. Furthermore, lactic acid extract can be used as a ingredient to develop functional foods as a mineral source.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 7
• CONTENTS ... 11
• 목 차 ... 15
• 제1장 연구개발 과제의 개요 ... 19
• 제1절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 19
• 제2절 연구 목표 ... 20
• 제3절 연구개발의 범위 및 내용 ... 20
• 제2장 국내외 기술개발 현황 ... 22
• 제1절 국내·외 관련분야에 대한 기술개발현황 ... 22
• 제2절 연구결과가 국내·외 기술개발현황에서 차지하는 위치 ... 25
• 제3장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 29
• 제1절 젓갈 미생물 균주분리 및 보존 ... 29
• 1. 젓갈 미생물 분리를 위한 젓갈 구입 ... 29
• 2. 젓갈 미생물 배양 선발 및 생리활성 확인 ... 29
• 가. 1차 선발 ... 29
• 나. 2차 선발 ... 29
• 다. 생리활성 확인 ... 29
• 라. 균주의 보존 ... 33
• 제2절 젓갈 미생물 추출물의 생리활성 확인 ... 34
• 1. 젓갈 미생물의 액체 배양으로부터 시료의 제조 ... 34
• 2. 젓갈 미생물로부터 항산화 물질의 최적 추출 공정 ... 34
• 3. 생리활성검색 실험 ... 34
• 가. 항산화 활성 ... 34
• 나. 인체 유래 암세포에 대한 세포 독성 효과 ... 38
• 다. Gelatin zymography를 이용한 MMP(matrix metalloproteinase)활성측정 ... 41
• 제3절 Colloidal chitin 분해 미생물 분리 및 동정 ... 42
• 1. 가공 폐기물인 홍게 껍질로부터 chitin 제조 ... 42
• 2. Colloidal chitin의 제조 ... 43
• 3. Colloidal chitin 배지 제작 ... 43
• 4. 키틴 분해 미생물 확인 ... 44
• 5. 키틴 분해 미생물의 형태학적·생화학적 특성 및 16S rRNA 유전자 분석 ... 44
• 가. 미생물동정을 위한 분자생물학적 분류 ... 44
• 나. 형태 및 생화학적 특성규명 ... 45
• 제4절 중점연구대상 시료인 CGH18(Bacillus idriensis)의 배양, 추출, 분획 및 활성 ... 53
• 1. 중점연구대상 시료 선정 ... 53
• 2. CGH18의 최적 배양 조건 확립 ... 53
• 3. CGH18(B. idriensis)의 배양액으로부터 추출 및 분획 ... 54
• 4. CGH18(Bacillus idriensis)의 추출물 및 분획물의 생리활성 검색 ... 54
• 가. 항산화 활성 검색 ... 54
• 나. 인체 유래 암세포에 대한 세포 독성 효과 ... 58
• 제5절 미생물로부터 생리활성 물질 분리 와 유도체들의 합성,구조 분석 및 생리활성 실험 ... 61
• 1. CGH18 분획물로부터 화합물의 분리 ... 61
• 2. 유도체의 합성 ... 81
• 가. compound 7, 8, 9 합성 ... 81
• 나. compound 10, 11 합성 ... 81
• 다. 유도체들의 구조결정 ... 82
• 3. 분리된 화합물과 유도체들의 생리활성 검색 ... 90
• 가. 항산화 활성 검색 ... 90
• 나. 인체 유래 암세포에 대한 세포 독성 효과 ... 96
• 다. 항염증 효과 ... 98
• 라. 사람 섬유아세포 (HDF)에서 자외선 손상 방어 효과 ... 98
• 제6절 홍게 다리껍질로부터 회분, 단백질, 카로티노이드 추출 ... 102
• 1. 재료 및 시약 ... 102
• 2. 추출 조건 설정 및 수율 비교 ... 102
• 가. NaOH를 이용한 단백질 분리 ... 102
• 나. 다양한 농도의 젖산을 이용한 회분 추출 수율 비교 ... 103
• 다. 젖산과 주정의 처리 순서에 따른 회분과 단백질, 카로티노이드 색소 수율 비교 ... 104
• 라. K2CO3를 이용한 단백질 추출 ... 106
• 마. 단백분해효소를 이용한 단백질 분해 ... 106
• 바. 효소의 복합처리에 의한 단백질 분해 ... 113
• 제7절 홍게 다리껍질 추출물의 특성 ... 115
• 1. 젖산 추출에 의한 홍게 다리껍질 단백질의 특성 ... 115
• 가. 유리아미노산 조성 ... 115
• 나. 단백질 분자량 ... 117
• 2. 효소 처리에 의한 홍게 다리껍질 단백질의 특성 ... 117
• 가. 단독효소처리에 의한 단백질 특성 ... 117
• 나. 혼합효소 처리에 의한 단백질 특성 ... 118
• 3. 홍게 다리껍질 젖산추출물의 일반성분 및 무기질 분석 ... 124
• 가. 일반성분 분석 방법 ... 124
• 나. 일반성분 조성 ... 124
• 다. 무기질 조성 ... 124
• 4. 홍게 다리껍질 주정 추출물의 특성 ... 125
• 가. HPLC를 이용한 carotenoid 함량 분석 ... 125
• 나. Catotenoid 함량 ... 126
• 제8절 홍게 다리껍질 추출물의 생리활성 ... 127
• 1. 홍게 다리껍질 주정추출물의 항산화 및 항염증 활성 ... 127
• 가. 홍게 다리껍질 주정추출물의 in vitro 항산화 활성 ... 127
• 나. 홍게 다리껍질 주정 추출물의 in vivo 항산화 활성 ... 131
• 2. 키틴배지 미생물 유래 diketopiperazine의 항산화 및 항염증 활성 ... 145
• 가. 키틴배지 미생물 유래 diketopiperazine의 in vitro 항산화 활성 ... 145
• 나. 키틴배지 미생물 유래 diketopiperazine의 in vivo 항산화 활성 ... 145
• 제9절 홍게 다리껍질 젖산추출물의 단회 투여 독성실험 ... 158
• 1. 동물사육 및 실험계획 ... 158
• 2. 체중변화 ... 158
• 3. 일반증상 관찰 ... 159
• 4. 장기의 무게 ... 160
• 5. 간독성 여부 ... 162
• 제10절 홍게 다리껍질 젖산추출물의 기능성 소재로서의 특징 ... 163
• 1. 유화력 및 유화안정성 ... 163
• 가. 유화력 및 유화안정성 측정 방법 ... 163
• 나. 유화력 및 유화안정에 대한 젖산추출물의 특성 ... 163
• 2. 유지 및 수분 흡착력 ... 164
• 가. 유지 및 수분 흡착력 측정 방법 ... 164
• 나. 유지 및 수분 흡착력에 대한 홍게 다리껍질 추출물의 특성 ... 164
• 3. 보습력 ... 165
• 가. 시간변화에 따른 보습력 측정 방법 ... 165
• 나. 홍게 다리껍질 젖산추출물의 보습력 ... 165
• 제11절 홍게 다리껍질 젖산추출물을 첨가한 기능성 제품개발 ... 166
• 1. 홍게 다리껍질 젖산추출물을 첨가하여 조제한 기능성 식빵 ... 166
• 가. 식빵의 제조 ... 166
• 나. 식빵의 외형 ... 167
• 다. 젖산추출물을 첨가한 식빵의 중량 및 길이와 높이 ... 168
• 라. 수분함량 ... 168
• 마. 물성 특성 ... 169
• 바. 관능적 특성 ... 169
• 2. 홍게 다리껍질 젖산추출물을 첨가한 머핀 개발 ... 170
• 가. 홍게 다리껍질 젖산추출물을 첨가한 머핀의 제조 ... 170
• 나. 홍게 다리껍질 젖산추출물을 첨가한 머핀의 관능적 특성 ... 171
• 3. 홍게 다리껍질 젖산추출물을 첨가한 쿠키 개발 ... 173
• 가. 홍게 다리껍질 추출물을 첨가한 쿠키의 제조 ... 173
• 나. 홍게 다리껍질 추출물을 첨가한 쿠키의 관능적 특성 ... 174
• 4. 홍게 다리껍질 젖산추출물 첨가한 기능성 마요네즈 개발 ... 175
• 가. 마요네즈 제조 ... 175
• 나. 유화안정성 ... 175
• 다. 관능 특성 ... 177
• 5. 홍게 다리껍질 젖산추출물을 첨가한 보습기능 향상 화장품 개발 ... 178
• 가. 화장품 제조 ... 178
• 나. 보습효과 ... 179
• 제4장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 181
• 1. 목표 달성도 ... 181
• 2. 관련분야에의 기여 ... 182
• 제5장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 184
• 1. 실용화·산업화 계획(기술실시 등) ... 184
• 2. 경제성 분석 ... 184
• 3. 교육·지도·홍보 등 기술 확산 계획 ... 184
• 4. 특허 출원 및 발표논문 ... 185
• 3. 학술대회 발표논문 ... 187
• 4. 추가연구 및 타 연구에의 활용 계획 ... 188
• 제6장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 189
• 제7장 연구시설 장비 현황 ... 190
• 제8장 참고문헌 ... 191
• 연구개발보고서 초록 ... 195
• 끝페이지 ... 197